Citometria de Fluxo

1. Citometria de Fluxo • Citometria: Análise quantitativa de parâmetros celulares (células, núcleos, cromossomas, mitocôndrias, etc) • Citometria de Fluxo: Análise multiparamétrica de partículas (uma a uma) em suspensão.

2. Princípio: • Fazer passar as partículas em suspensão, de uma forma alinhada, por um feixe de luz • A interacção das partículas com o feixe gera sinais que são captados por detectores apropriados • A informação produzida pode ser gerada: • Pela dispersão do feixe de luz • Pela luz emitida por fluorocromos após excitação pelo feixe de luz

3. O que é um Citómetro de Fluxo?

4. Requisitos Básicos num Citómetro de Fluxo • Suspensão de partículas • Fluxo laminar • Fonte de iluminação • Câmara de Fluxo • Filtração da dispersão de luz e fluorescência • Captação da dispersão de luz e fluorescência • Conversão dos sinais em valores analógico-digitais • Aquisição, Processamento, Análise e Armazenamento no computador Fluídos Óptica Electrónica

5. Fluídos • Injecção da amostra no líquido de envolvimento (sheath fluid), passando por um pequeno orifício central do fluxo (50-300 µm) • As partículas fluem no centro, não se misturando com o restante líquido de envolvimento • A injecção da amostra em fluxo laminar e a regulação da pressão são conseguidas através: - Pressão Diferencial - Velocidade de Fluxo - Fluxo Contínuo

6. Câmara de Fluxo Agulha de injecção Laser Líquido de envolvimento Dispersão laser Ponto de Hidrofocagem

7. Óptica • Fontes de iluminação: • Lâmpadas de Mercúrio • Lasers • Emite num comprimento de onda (ex: 488 nm- azul), monocromático. • Produz um feixe de luz coerente

8. Laser

9. Laser Sensor de FS Fotosensor de Dispersão Frontal (FS) • Capta a intensidade da dispersão frontal • A intensidade da dispersão frontal é proporcional ao tamanho e forma das partículas .

10. Laser Sensor de FS Sensor SS 900 Fotosensor de Dispersão Lateral (SS) • Capta a intensidade e luz dispersa a 90o • A intensidade dessa dispersão é proporcional ao tamanho, granularidade e forma das partículas

11. Laser Sensor de FS Detectores de Fluorescência (PMT1, PMT4 etc.) Dispersão da Fluorescência • A fluorescência emitida é detectada por fotosensores que recebem o comprimento de onda seleccionado • A especificidade da detecção de cada sensor é controlada pela selecção do comprimento de onda, através de uma conjugação de filtros e de espelhos.

12. Currently Available Fluorochromes (Visible Light Emission) Fluorochrome Laser (nm) Emission (nm) FITC 488 525 Cy3 488 565 R-PE (PE) 488 575 Pe-Cy5 (TC1) 488 667 PerCP (BD2) 488 675 PerCP/Cy5.5 (BD) 488 695 Texas Red 595 615 APC 633, 635 660 Cy5 633, 635 667 Tipos de fluorocromos

13. 488 350 457 514 610 632 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Texas Red PI Ethidium PE FITC Espectros de Excitação / Emissão

14. Características dos fluorocromos: 1)Emissão adequada (> 600 nm) de forma a minimizar problemas de autofluorescência 2) Emissâo de intensidade significativamente maior que a de autofluorescência 3) Espectro não sobreposto com outros fluorocromos 4) Facilmente conjugável com anticorpos • Fuorescências derivadas de Energias de Transferência • Sobreposição de emissão de luz dos fluocromos • Tranferência dessa luz entre o 1º e o 2º fluorocromo • O segundo emite num comprimento de onda superior ao primeiro

15. Filtro ou Espelho Dicrónico Colocado a 45o Fonte de Luz Luz Transmitida Luz Reflectida

16. Captação dos Parâmetros de Análise: PMT 4 PMT Filtros Dicróicos 3 Câmara de Fluxo PMT 2 Filtros Bandpass Fotosensores PMT 1 Laser

17. Electrónica • Processamento electrónico do sinal gerado nos sensores que é traduzido num histograma ou scatter plot

18. Complexidade Antigénios celulares Tamanho Metabolismos Enzimas Receptores ADN Citoquinas O que pode então dizer um Citómetro de fluxo de uma célula? Tamanho (FSC) Complexidade (SSC) Fluorescência relativa.(FL1, FL2, FL3,

19. Aplicações • Imunologia • Hematologia • Anatomia patológica • Biologia celular • Oncologia

20. G0 /G1 G2 /M S 0 200 600 800 1000 4N 2N DNA content Aplicações diversas • Detecção de apoptose • Permeabilidade membranar • Mudanças do conteúdo • de DNA • Estudos enzimáticos • funcionais • Resistência a fármacos

21. Imunologia - Aplicações práticas • Separação de células sanguíneas • Diferenciação de sub populações de linfócitos T • Diferenciação linfócitos B • Diferenciação de células NK • Quantificação antigénica • Variações linfoproliferativas (idade, • , imunodeficiências, neoplasias, transplantes, • doenças autoimunes, inflamações) • Fagocitose

22. Granulócitos Monocitos Linfocitos • Separação de células sanguíneas

23. Diferenciação da subpopulação de linfócitos Os linfócitos T, originados no Timo experimentam maturação que resulta de um processo de selecção positiva e negativa, durante o qual se formam as células CD4 e CD8. Os linfócitos B originados na medula óssea vão expressando sequencialmente antigénios específicos CD19+, CD10+ e CD20+, até se diferenciarem terminalmente em Igs. As células NK carecem de marcadores das células T ou B, mas são constitutivamente citotoxicas. Na sua diferenciação associam-se a marcadores de funções linfocitárias: CD16

24. Quantificação antigénica/ maturação

25. FACS • Fluorescence-activated cell sorter • Permite separar subpopulações de linfócitos com base nas diferentes proteínas expressas á superfície (B, TCD4, TCD8) • Cada tipo celular é marcado com um anticorpo específico que se encontra acoplado a um corante fluorescente. • O citómetro de fluxo detecta e conta individualmente as células que passam através do laser

26. Sensor Fs 488 nm laser Detectores de Fluorescências - Placas Carregadas + Tubos para Recolha do Produto Separado

27. FACS: desenhado para a análise computarizada de células e separaçaõ das mesmas • No exemplo, uma população celular mista é marcada com 2 anticorpos específicos de antigénios de superfície : anti-A e anti-B. Os anticorpos anti-A são marcados com fluoresceina e os anti-B com Rodamina. Toda a população é introduzida na camara de FACS. As células vão ser expelidas pelo “nozzle” gerando microgotas, cada contendo uma única célula. Cada microgota assim que expelida recebe uma pequena carga eléctrica-excitação do fluorocromo, aquando da sua passagem pelo laser, sendo a intensidade da fluorescência emitida e detectada no computador. Esta carga eléctrica dirigida por 2 placas de deflecção faz que cada microgota possa ser defletida do seu caminho e colectada para um tubo. Isto permite separar as populações com perfis diferentes- População A e População B. No computador cada “dot” representa uma célula, e as células que “caem” à esquerda inferior do quadrante do scatter são consideradas background- não reagiram c/ anti-A ou anti-B.

28. Aplicações clínicas: são múltiplas principalmente na detecção de antigénios “target” nas células sanguíneas • Classificação de leucemias • Detecção de HIV • Marcadores tumorais • Na previsão da evolução do curso de doença • Detecção microbiológica : bactérias, fungos,parasitas e vírus • Detecção e quantificação de ac.nucleicos virais e antigénios virais • Teste de susceptibilidade a drogas