A mesterséges termékenyítéssel összefüggő andrológiai vizsgálatok

1. A mesterséges termékenyítéssel összefüggő andrológiai vizsgálatok Dr. Gábor György tudományos főmunkatárs, az állatorvos-tudomány kandidátusa, ÁTK, Herceghalom

2. A szaporodásbiológiával kapcsolatos legérdekesebb elméletek ill. felfedezések I. • Arisztotelész (ie. 384-322)  a magzat a menstruációs vérből származik  eltelik 1884 (!!!) év • Fallopius (1562)  felfedezi és leírja a petevezetőt  eltelik 11 év • Coiter (1573)  felfedezi és leírja a sárgatestet  eltelik 99 év • De Graaf (1672)  felfedezi és leírja a petefészek tüszőket  eltelik 5 év • Van Leewenhoek (1677)  felfedezi és leírja a spermiumokat az ondóban  eltelik 103 év • Spallazzani (1780)  felfedezi, hogy a spermium a termékenyítő ágens, és elvégzi az első mesterséges termékenyítést (kutya!)  eltelik 45 év • Dumas (1825) bebizonyítja, hogy a spermium a termékenyítő ágens

3. A szaporodásbiológiával kapcsolatos legérdekesebb elméletek ill. felfedezések II. A modern szaporodásbiológia kezdete (1855- napjainkig) • Ivarzás szinkronizálás • Sperma mélyhűtés • endokrinológia • Ivar-specifikus sperma és embrió • Fogamzásgátlás • Mesterséges termékenyítés • Embrió tenyésztés és átültetés • A terhesség biokémiai és képalkotás útján történő detektálása • In vitro fertilizáció • ART (Assisted Reproductive Technologies) • ICSI (Intra Cytoplasmatic Semen Injection)

4. A mesterséges termékenyítés rövid története • Az első emlékek a mesterséges termékenyítésről i.e. 800-ból származnak: az asszírok nővényeket és állatokat termékenyítettek meg művi úton. • Egy arab törzsfőnök 1286-ban az ellenséges törzs egyik híres ménjétől ondót lopott. Gyapot csomagban hazavitte és sárló kancájának hüvelyébe téve, fogamzást ért el. Ezeket a legendaszámba menő emlékeket a XVII. és XVIII. században tudományos közlemények cáfolták. • A XVI. században MALPHIGI és BIBIENA céltudatos kísérleteket végeztek selyemhernyó petéivel és azokat hímekből kipréselt titokzatos "Elixir-vitae"-vel akarták megtermékenyíteni. • 1677 novemberében LEEUWENHOEK (1632-1723) holland természetkutató, a mikroszkóp feltalálója fedezte fel és írta le a férfi ondósejtet. • A XVIII. században JACOBI pisztráng és lazacikrák sikeres termékenyítését oldotta meg, amit 1763-ban Valtheim megismételt. • Lazzaro Spallanzani kísérleteivel igazolja, hogy a békapetéből tiszta vízben csak akkor fejlődnek békaporontyok, ha azokat hímbékától nyert spermafolyadékkal összehozta. 1779-ben kan kutyától nyert spermát fecskendezett egy ivarzó szuka méhébe, majd azt ellésig a szobájában tartotta és 62 nap múlva a szuka megellett. • XVII. sz. közepén Regnier de Graaf leírta a petefészken kialakuló harmadrendű follikulust (Graaf tüsző) • 1827-ben Karl-Ernst von Baer felfedezte a nőstény kutya harmadrendű tüszőjében a petesejtet. Albert von Koelliker 1841-ben leírta a spermatogenezist. • SIMS 1866-ban homológ (a házastárs spermájával történő) termékenyítés mellett heterológ (más férfitól származó spermával) termékenyítést is sikerrel végrehajtott. A módszer humán területen való alkalmazását 1897-ben pápai bulla tiltotta meg. • Cselhovszki 1888-ban a mén spermavételéről, Lidemann 1895-ben a kanca sikeres termékenyítéséről adott hírt Oroszországban. • Amantea (1914-ben) kutya számára alkalmas mesterséges műhüvelyt készített. • McKenzie (1931-ben) Kanadában sertés-kan sperma-vételhez (!) készített műhüvelyt. • Roemmele (1926-ban a szarvasmarha műhüvelye) • Spermavétel (az ondóvezető ampullájának masszálásával, Semice, 1925; • Elektroejakuláció, Gun 1933 • A spermadozirozás és -hígítás kidolgozása (Milovanov, 1932) • A spermakonzerválás (Ivanov, 1930) • A spermabírálati eljárás kialakítása (Roemele, 1927; Ivanov, 1930; Marshall, 1930) • Sörensen 1940-ben a spermagranulálás módszerét dolgozta ki. • Schaffner és munkatársai 1941-ben a kakas-sperma mélyhűtését -74 °C-on végezték el. • Polge és Rowson 1950-ben ampullában tárolt bikaspermát -79 °C-on mélyhűtötte. • Nagasa és munkatársai 1958-ban szárazjégen pelletálták és folyékony nitrogénben (-196 °C-on) tárolták a bikaspermát. • Cassou kidolgozta a műszalmás sperma-feldolgozási eljárást. Az inszeminálásra műanyag katétereket kezdtek alkalmazni. A világon forgalmazott sperma kiszerelése 90%-ban műszalmában történik. • A sertéssperma (és -embrió) - mint ismeretes - nehezebben mélyhűthető. Sikerült a friss sperma életben tartását 50 órára hosszabbítani A MT-t rendszerint a kocák ivarzás-szinkronizálásával kötik össze.

5. A mesterséges termékenyítés magyarországi története • Treisz János méneskari állatorvos 1902-től a mezőhegyesi, majd 1913-1916-ban a kisbéri ménesben inszeminálta a kancákat eredményesen. • Marosffy Lajos kisbéri fő-állatorvos Milánóban Lazzaro Spallanzani Intézetében tanulmányozta az eljáráshoz fűződő új kutatási eredményeket. Az influenza okozta vetélési járványkárok csökkentése érdekében is sikerrel alkalmazta a módszert. • Az Állatorvosi Főiskola Szülészeti Klinikáján Hetzel és munkatársai angol telivér kancákon (!?) (az angol telivér-tenyésztésben a MT alkalmazását a telivértenyésztők szervezetei tiltják) kísérelték meg az eljárás alkalmazását, más források szerint teheneket is termékenyítettek. • A II. világháború után a súlyosan károsodott állatállomány gyors ütemű szaporítása és minőségi javítása lehetőséget teremtett arra, hogy a MT komoly szerepet kapjon az állattenyésztésben. • A módszert elsőként 1947-ben a lótenyésztésben • 1948-ban a szarvasmarha-tenyésztésben • 1953-ban a juhtenyésztésben • 1957 (Pásztor Lajos) a sertésnél is alkalmazták, 1970-től nagyüzemben is. • A lótenyésztésben 1947-1951-ig 120 fedeztető állomást fejlesztettek mesterséges termékenyítő állomássá. Ebben az időben a tenyészkanca-állomány 25-30%-át (60-63 ezer kancát) mesterségesen termékenyítették. • A szarvasmarha-tenyésztésben a MT-t 1948-ban kezdték - kezdetben kísérleti jelleggel - alkalmazni, és 10 év alatt kiépítették a termékenyítőállomások országos hálózatát. 1966-tól kezdve gyakorlatilag a teljes tejhasznú szarvasmarha-állományt (94-96%) mesterségesen termékenyítik. • 1949-ben Budapesten létrehozták a Központi Mesterséges Termékenyítő Főállomást, amely 1978-ban Gödöllőre költözött. • A hazai mesterséges termékenyítés bevezetésében, az eljárás elterjesztésében és az országos hálózat kiépítésében elévülhetetlen érdemeket szerzett Mészáros István professzor (1910-), akit 1963-ban Kossuth-díjjal tüntettek ki. • A juhtenyésztésben 1953-ban kezdték a kísérleti munkát Hortobágyon és Karcagon 2000 anyajuh és toklyó termékenyítésével. Már kezdetben 93,5%-os vemhességet értek el. Az eljárás gyors terjedésére jellemző, hogy néhány év alatt az anyajuhállománynak kereken a felét inszeminálták. Napjainkban az eljárás iránti érdeklődés az ágazat kedvezőtlen közgazdasági helyzete miatt nem fejlődik, sőt hanyatlásnak indult. • Jelentős előrehaladást értek el a MT-nek a sertésnél történő alkalmazásával, elsősorban az "iparszerű" jelleggel működő nagyüzemi sertéstelepeken. A sertés sajátos szaporodásbiológiai adottságai, a sperma és az embrió mélyhűtésével kapcsolatos nehézségek azonban a módszer alkalmazásának korlátokat szabnak.

6. Mi szükséges a termékenyüléshez? 50 % 50 %

7. A hím nemi szervek anatómiájaI. 1. Hereborék (scrotum) • A hereborék bőrében lévő verejték- és faggyúmirigyek ill. izmok segítségével alacsonyabb hőmérsékletet biztosít a spermatogenezishez • mechanikai védelem • sertésnél a szűk üreg és a szoros felfüggesztés miatt kevésbé hatékony a hőreguláció - a környezetre jobban kell ügyelni (hőmérséklet, légmozgás, pára)

8. A hím nemi szervek anatómiájaII./a 2./a Here (testis) • A rostos burokból (tunica albuginea) induló sövények osztják lobulusokra. Ennek további szátágazódása az interlobuláris kötőszövet a Leydig sejtekkel • A lobulusokban vannak a kanyarulatos csatornák, amik a Sertoli és a csírahámsejteket tartalmazzák • Sertoli sejtek: spermiogenesis • Leydig sejtek: tesztoszteron termelés • spermatogenesis hossza a sertéskanban: 40 nap, bikában 56 nap

9. A hím nemi szervek anatómiájaII./b 2./a Here (testis) • a here mérete és működése között szoros a korreláció: a korral együtt nő a here mérete és javul a spermatermelése • a here ultrahangos szerkezete és a spermatermelés között negatív a korreláció • több folyadék a herében jobb thermoregulációt jelent, ami a sperma minőségét is javítja

10. A hím nemi szervek anatómiájaIII. 3. Mellékhere (epididymis) (fej, törzs, farok) Feladatai: 1. ondósejtek érése, 2. Tárolása, 3. Továbbítása a heréből az ondóvezetőbe, 4. Ondóplasma képzése 4. Ondózsinór (funiculus spermaticus) komplex szerv. Az ondóvezetőn (ductus deferens) kívül ereket, idegeket, nyirokereket, izmokat tartalmaz. Az arteria es véna spermatica interna itt halad és alakítja ki a plexus pampiniformist (repkényfonat), ami a here elsőszámú hőszabályozója.

11. A hím nemi szervek anatómiája (sertés kan)IV. 5. Járulékos nemi mirigyek (az ondóplazmát szolgáltatják) a. ondóhólyag (hatalmas: 15x8x3 cm), a váladékban sok kén és foszfor b. prostata az ondó 30-60 %-t termeli c. Cowper-f. mirigy váladéka az ejakuláció végén ürül, csirízszerű 6. Hímvessző (penis) A végén spirális galea penis. A penis tengelyét az erős kötőszövetes corpus fibrosum alkotja.

12. A hím nemi szervek anatómiája (bika)V. Járulékos nemi mirigyek, különbségek a kanhoz viszonyítva: a. ondóhólyag (mérete: 10-12 cm hosszú, 2 - 5 cm széles, 1,5-3 cm vastag, a plazma legnagyobb részét teszi ki, sok benne a K, fruktóz, citromsav, és tartalmaz prosztaglandint is. b. prostata kicsi, mérete fordítottan arányos a here méretével, az ondó 4-6 %-át teszi ki c. Cowper-f. mirigy váladéka az ejakuláció elején ürül, és átmossa” a húgycsövet

13. A hím nemi működés hormonális szabályozása

14. A hímek szexuális viselkedése a párzás idején

15. Mi a végső ”termék”?

16. A sperma minősége • Függ: a hímek korától, kihasználtságától, egészségi állapotától • hímivarú : nőivarú egyedek aránya • minimális kor a tenyésztésbe vételkor • fedezési gyakoriság • Két hím használata egy nőivarú egyednél elfedheti a fertilitási problémákat - akár műhibaként is lehet értékelni, bár a heterospermás termékenyítési eredmények általában jobbak • Minimális inszemináló dózis • Az ovuláció időpontjában a spermiumok a tárolóból az ampulla felé mozognak, ahol is a termékenyülés megtörténik. • Az ejakulátum mennyisége • Az ejakulátum sűrűsége • Motilitása > 65 % • abnormális sejtek aránya < 20 %

17. A spermavétel és higiéniája • Elektroroejakulálás esetén a rektálisan bevezetett elektródák segítségével a járulékos nemi mirigyek és a gerincvelő ejakulációs centrum tájékán különböző feszültségű- és erősségű elektromos impulzusokat alkalmaznak. Néhány pere múlva a húgycsőből ondó kezd folyni, amit fel lehet fogni. Miután a járulékos mirigyeket közvetlenül izgatják, az ejakulátum térfogata nagyobb, de kevésbé sűrű. Ennek ellenére az ejakulátum néha alkalmas mesterséges termékenyítésre. Az eljárás hátrányaként kell megjegyezni, hogy a pénisz általában csak kicsit nyúlik ki a tasakból, s így a sperma szennyeződhet. • A műhüvelyes és manuális ondóvétel során az ondót adó kan legyen mentes specifikus fertőző csíráktól. A mindenütt, de különösen a tasakban előforduló mikroorganizmusok miatt teljesen csíramentes ejakulátumot nem lehet nyerni. Ha a csírák nagy számban fordulnak elő - a spermahígítóhoz hozzákevert antibiotikumok ellenére - a termékenyítési eredményt kedvezőtlenül befolyásolhatják, vagy a megtermékenyített állatoknál a méh megbetegedései következhetnek be. • A személyzet tiszta munkaruhát viseljen. • Helyiségek. Az ugrató helyiséget, a spermavétel befejeztével naponta alaposan ki kell takarítani, és fertőtleníteni. • Kanok. A kanok optimális tartását (rendszeres tisztítás, megfelelő alom, stb.) eleve feltételezzük. Spermavételhez a kanokat tisztán kell felhajtani. Az állatokat szükség esetén meg kell mosni, de a spermavételre már meg kell szárítani. • Spermavétel. A műhüvelyt ugratás után akkor is sterilizálni kell, ha új belső részt húznak fel. A spermavétellel megbízott személy viseljen minden kannál új, eldobható kesztyűt. Az üvegeszközöket szárítószekrényben 3 órán keresztül 180 °C-on sterilizálják.

18. A spermiumok bírálata: 1. makroszkópos vizsgálat • Az ejakulátum mennyisége. • Szín, konzisztencia, idegen anyagok. Az ejakulátum színe a fehérestől az elefántcsontszínig. A sárga szint flavonok okozzák és normálisnak tekinthető. Az ejakulátum vöröses illetve barnás színeződése friss vagy régebbi vért jelez. • A spermaminta konzisztenciája a koncentrációtól függ. A tejsavószerű vagy vízszerű általában nem elég sűrű. A szín és konzisztencia alapján becsült koncentrációt mérésekkel állapítják meg. A friss kansperma pH-ja 7-8. • A koncentráció meghatározása. Fotométer vagy részecskeszámláló berendezés használatakor ezeket az eszközöket előzetesen számlálókamrában történő sper-mium meghatározással kell hitelesíteni. Csak a fejeket számolják, farokkal vagy farok nélkül, azokat, melyek a négyzetek szélein a határvonalakon fenn és balra - vagy lenn és jobbra - találhatók. • Fotométer: A fotométer a meghatározott mértékben higított sperma fénytörését méri. A mérés hitelesítéséhez a fotométer értékeit nagyobb számú spermaminta számlálókamrás eredményeihez kell viszonyítani. • Részecskeszámláló berendezés. Ezek a készülékek meghatározott nagyságú részecskéket ismert méretű kapillárison keresztül történő áramláskor elektronikus úton számolnak meg. • A napi munkában a számlálókamra használata körülményes. A rutin jellegű koncentrációmérésnél normális ejakulátumok esetében mind a fotométer, mind a számlálókamra felhasználható.

19. A spermiumok bírálata: 2. mikroszkópos vizsgálat • melegítőasztallal és jó fáziskontraszt optikával ellátott mikroszkóp • az üvegeszközök előmelegítésére további, a mikroszkóptól független melegítő asztal is kell • tömegmozgás: a spermiumok összességének halvonulás-szerű, hullámzó mozgása 50-100-szoros nagyítással, 37 °C-os melegítő tárgyasztalon. Követelmény: élénk tömegmozgás • előrehaladó mozgás: az aktívan előrehaladó spermiumok százalékos aránya 200-400-szoros nagyításban, melegítő tárgyasztalon 37 °C-on azonos rétegvastagságban (Makler kamra vagy Microcell lemez). • A tárgylemez és fedőlemez tisztaságára fokozott figyelmet kell fordítani. • A jó ondó közvetlenül a levétel és vagy hígítás után 70%-os előrehaladó mozgást mutat, az 50%-os tömegmozgást mutató ejakulátumot egyáltalán nem szabad felhasználni.

20. A spermiumok bírálata: 3. mikroszkópos, számítógépes (CASA) vizsgálat • függetlenítik a spermabírálatot a vizsgálatot végző személy szubjektivitásától • negatív fáziskontraszt megvilágításban a sötét háttérben világosan tűnnek fel a spermiumok • videokamerán keresztüli vizsgálat • pontos vizsgálatokhoz a következő speciális tárgylemezek szükségesek • Egyszer használatos, előre lefedett mikrocell tárgylemez. A kapillaritás elvén tölthető fel egy-egy csepp spermával. 10 vagy 20 mikronos vastagságban készülnek, egy lemezen 4 minta vizsgálható. Eldobható, de költséges. • Üvegkanül-lapos üvegkapilláris. 200 mikronos minta behelyezésére alkalmas. Csak igen híg (0,05-2,0 millió spermium/ml) minta vizsgálatára alkalmas. • Makler-féle spermavizsgáló kamra használható. Egy csepp mintával könnyen tölthető, pontosan tartja a 10 mikronos vastagságot, a fedőlemezen lévő Bürker-kamra-szerű hálózat a gép beállításának ellenőrzésére is alkalmas. Több kép is vizsgálható ugyanabból a mintából, átlagot számolva ez adja a legpontosabb eredményt. Ez a kamra 2 millió/ml-től 100-150 millió/ml koncentrációjú spermaminták vizsgálatára alkalmas.

23. Spermiumanomáliák (Wekerle, 1983)

24. Mit vizsgáljunk előzetesen andrológiai szempontból? • Hím nemi szervek KAN BIKA hereborék (méret, állapot) hereborék (méret, állapot) here (méret, konzisztencia, struktúra) here (méret, konzisztencia, struktúra) mellékhere (méret, állapot) mellékhere (méret, állapot) penis (tasakkal együtt) penis (tasakkal együtt) ondóhólyag??

25. Hereborék és here morfológiai vizsgálatok • scrotal circumference (SC), hereborék körmérete: Coulter scrotal tape (bika, esetleg kos) • hereborék formája: digital camera (bika, kan, kos) • here konzisztencia (Consitest electronic tonometer; bika, kan, kos)

26. Coulter Scrotal Tape

27. Scrotal forms (bulls)

28. Scrotal forms (boars)

29. Here ultrahangos vizsgálata (testicular echotexture, bika, kan, kos, kutya) • B-mode scannert (Pie Medical, Model 100 LC VET) használunk, 8 MHz-es lineáris transducerrel. Standard ultrahang erősséget alkalmazunk. • A transducert mindkét here esetében középen, a hossztengelyre merőlegesen helyezzük rá. Egy általunk erre a célra kifejlesztett elektro-mechanikus eszközbe helyezzük a fejet a vizsgálat előtt, ami segít abban, hogy minden vizsgálat során azonos erővel nyomjuk be a hereborék felszínét, ami az azonos gél vastagságot is biztosítja. • Kb. 0.8 kg/cm2 nyomást fejtünk ki, és ekkor egy rugós kapcsolót hozunk működésbe, ami az ultrahang berendezésben a képet megállítja, majd floppy disk-re mentjük a képet.

30. A saját fejlesztésű (auto image freezing funkció) elektro-mechanikus transducer tartó

31. Consitest electronikus tonométer (bika, kan, kos) • Két rugós vizsgálófejet használunk, a vizsgálat mindig 1500 gram/cm2 nyomással történik. Mivel a két fej mérete erősen eltér egymástól, (1:3), a vizsgált szövetbe csak a kisebbik hatol be, a nagyobbik a felszínen marad. A beállított nyomás érték elérésekor a két fej felszíne közötti távolságot méri és rögzíti a kijelzőn a műszer, mm-ben kifejezve, 0.1 mm pontossággal. A bonyolult elektro-mechanika egy lineáris mozgást alakít át körmozgássá, majd egy ilyen módon mozgásba hozott körben mozgó kód (perforált) lemez megszakít egy infravörös fényt. Az impulzusokat egy mikroprocesszor számolja, és az összesített eredményt jeleníti meg a kijelzőn.

32. A here echotexture (ET) vizsgálata Scanner 100 ultrahanggal, 8 MHz-s lineáris fejjel left testis right testis • A bal és a jobb here képe külön kerül rögzítésre floppy disken. Az átlagos szürke szint vizsgálata egy 256-os szürke skálán történik, ahol: 0 a sötét, és 255 a fehér.

33. ET értékelése az adatbázis kezelésére kifejlesztett TesTracto szoftverrel

34. A szürke szintek eloszlásának értékelése a szoftver segítségével

35. A morfológiai adatok gyakorlati értékelése - összevetés a sperma termeléssel • Sperma minták: • friss: kan • mélyhűtött: bika • Vizsgálva: Az ejakulátumok összes spermiumszáma (TNS), az élő és a motilis spermiumok %-os aránya a CASPAR szoftver (Makler kamra: 10 mm mélység) segítségével

36. Eredmények

38. H-F bikák vizuálisan vizsgált sperma minták (n=88)

39. Diagnózis az előrejelzéshez • A SC, ET és TM méréseken alapul. A bikák vizsgálata minimum 2 hónappal a spermatermelés előtt. • A sperma vizsgálata legalább 2 hónappal a spermatermelés megkezdése után. Vizsgált paraméterek: SV, SD, TSN • NP - No predicted semen production problem • PP - Possible predicted semen production problem • NUAI - Prediction: not useful as a breeding bull

40. Az előrejelzés eredményessége 1998-ban

41. Az előrejelzés eredményessége 1999-ben

42. Az inkorrekt diagnózisok lehetséges okai Calcification. Dg.: PP normal semen production 6 months later Small SC (20 cm at 8 months of age normal SC size (32 cm) and semen production4 months later

43. A selejtezés lehetséges okai Cryptorchidism Left testis: orchitis right testis: fibrosis