WEKTORY WYSPECJALIZOWANE Cechy budowy dobrych wektorów:

1. WEKTORY WYSPECJALIZOWANE Cechy budowy dobrych wektorów: rodzaj replikonu umożliwiający dużą liczbę kopii plazmidu, im więcej tym lepiej; 2) występowanie wielu unikalnych miejsc restrykcyjnych zgrupowanych w określonym obszarze plazmidu zwanym MCS lub miejscem wielokrotnego klonowania, im więcej tym lepiej;

2. 3) obszar MCS powinien być ograniczony specyficznymi promotorami dla wydajnych polimeraz RNA takich jak: polimeraza RNA T7, SP6 lub T3. Można to wykorzystać do otrzymania dużych ilości specyficznego transkryptu klonowanego fragmentu DNA w reakcji in vitro; 4) wektor może posiadać dodatkowe ori replikacji dla jednego z fagów filamentarnych (M13, f1), w celu potencjalnego wykorzystania plazmidu do otrzymywania DNA w formie jednoniciowej, kolistej matrycy, z przeznaczeniem do reakcji sekwencjonowania czy miejscowo-specyficznej mutagenezy; 5) wektor powinien posiadać elementy genetyczne wykorzystywane do selekcji rekombinantów.

3. Wektory do ekspresji genów (nadprodukcji białek) Wektory te umożliwiają ogromną nadprodukcję białek (stanowiącą od kilku do kilkudziesięciu procent ogólnej masy białek w komórce) wykorzystując właściwości wyselekcjonowanych,dobrze regulowanych i bardzo silnych promotorów.

4. Wektory do ekspresji genów (nadprodukcji białek) Istnieją dwa możliwe podejścia regulacji ekspresji badanego genu: • fuzje genowe transkrypcyjne - gen przeznaczony do ekspresji posiada własny rejon RBS i sekwencję kodującą (wektor dostarcza silnego promotora); • fuzje genowe translacyjne - gen przeznaczony do ekspresji musi być najczęściej produktem amplifikacji PCR, z przekształconym początkiem sekwencji kodującej, w taki sposób aby po przecięciu enzymem NdeI(CATATG) lub NcoI(CCATGG) pasował w istniejącą na plazmidzie ramkę odczytu. Tak jest jeśli fuzja dotyczy pierwszego kodonu inicjatorowego AUG. Powstaje wtedy białko niezmienione, dzikiego typu. Wektor w tego typu fuzjach dostarcza zatem promotor i rejon RBS, wraz z kodonem inicjatorowym ATG. Pozycje sekwencji SD i ATG narzucają jedyną możliwą ramkę odczytu.

5. Inaczej jest jeśli do utworzenia fuzji genowej wykorzystamy inne miejsce restrykcyjne, położone w miejscu wielokrotnego klonowania (MCS). • Miejsce to położone jest za kodonem inicjatorowym, ale umożliwia klonowanie, w którym sekwencja kodująca genu zachowa właściwą sobie ramkę odczytu. • Powstaje wtedy białko fuzyjne, z dodatkowymi aminokwasami na N- lub C-końcu. Ma to miejsce zwłaszcza, kiedy przeprowadzamy fuzje z różnego typu ogonkami peptydowymi (ang. tag), oferowanymi nam przez dany wektor.

6. Wykorzystanie tego typu możliwości znajduje zastosowanie głównie w ułatwianiu • oczyszczania produktów białkowych (dotyczy to m.in. peptydów fuzyjnych His-tag, S-tag) lub • ich identyfikacji przy pomocy specyficznych przeciwciał (dotyczy to m.in. peptydów fuzyjnych T7-tag, S-tag).

7. W wektorach ekspresyjnych powinno się unikać sytuacji, kiedy gen oporności na antybiotyk ma własny stosunkowo silny promotor lub jest w tej samej orientacji co gen główny. • Tworzy to sytuację współzawodnictwa między dwoma promotorami, co w efekcie prowadzi do ograniczenia produkcji białka rekombinacyjnego (głównego) i dwukrotnego spadku jej wydajności kosztem niepotrzebnego zwiększenia poziomu białka oporności na antybiotyk.

8. To że poziom białka dającego antybiotykooporność zwykle jest i tak nadmierny pokazuje przykład b-laktamazy. Produkcja tego białka osiągana z plazmidu pBR322 pozwala na wzrost bakterii w obecności 5 mg Ap na ml pożywkj (!). W przypadku plazmidu pUC wzrost bakterii jest możliwy w obecności ponad 20 mg antybiotyku na mililitr pożywki!

9. Wektory o szerokim zakresie gospodarzy Szerokie zastosowanie w badaniach podstawowych znalazły plazmidy o specjalnych cechach replikonu, pozwalających na propagację plazmidu w szerokim spektrum gospodarzy bakteryjnych (ang. broad-host-range plasmids). Do tej grupy należy np. replikon RK2 (z białkiem inicjatorowym TrfA kodowanym na plazmidzie), który dzięki dużej tolerancji jeśli chodzi o wymagania co do reszty białek replikacyjnych dostarczanych przez gospodarza bakteryjnego, może się replikować zarówno w E. coli jak i innych bakteriach Gram-ujemnych takich jak: Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Alcaligenes eurotropus, Azotobacter vinelandii, Azotobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Caulobacter crescentus, Acinetobacter calcoaceticus, Rhodopseudomonas sphaeroides. Oczywiście uzyskiwana liczba kopii plazmidu w poszczególnych gatunkach bakterii jest różna.

10. Wektory wahadłowe • Inną ciekawą grupą są wektory wahadłowe (ang. shuttle vectors). Są to plazmidy zawierające dwa różne origin replikacji, specyficzne dla organizmów niespokrewnionych, często dość odległych ewolucyjnie (np. dla bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich, oraz dla bakterii i drożdży, lub dla bakterii i wirusa eukariotycznego). Umożliwia to prowadzenie prac konstrukcyjnych nad pochodnymi plazmidu w bakteriach E. coli, a następnie jego wykorzystanie poprzez niezależną replikację (a także ekspresję specyficznych białek) w organizmie docelowym.

11. Fagmidy (ang.phagemids) • Są to wektory plazmidowe E. coli, posiadające dwa typy origin replikacji -wegetatywny, zwykle pochodna pUC, i warunkowy - replikon faga filamentarnego (f1 lub MI3). Wektory te dają możliwość otrzymywania jednoniciowego plazmidowego DNA, idealnego jako matryca do reakcji polimeryzacji DNA. Jest to możliwe po uaktywnieniu ori f1 lub M13, zakażając komórki gospodarza odpowiednim fagiem pomocniczym (helperowym). Fag taki dostarcza specyficznych białek do zainicjowania replikacji DNA i zapakowania cząstek potomnych we własną osłonkę białkową.

12. Wektory samobójcze (ang. suicide vectors) • Są to wektory nie mogące się replikować w komórce gospodarza lub mogące to robić tylko warunkowo (najczęściej posiadające temperaturo-wrażliwe replikony). Używane są do kontrolowanego i krótkotrwałego wprowadzania do komórek specyficznych aktywności biologicznych. Jedną z odmian tych wektorów są wektory integracyjne (ang. integrating vectors),które są wprowadzane do komórek z myślą ich samointegracji do określonego regionu genomu (na drodze RecA- zależnej rekombinacji homologicznej lub lnt-zależnej miejscowo specyficznej rekombinacji) lub losowo na drodze transpozycji.

13. Wektory do przygotowywania bibliotek genomowego DNA Charakteryzują się one: • ogromnym potencjałem do stabilnego utrzymywania dużych fragmentów DNA (50-1000 kpz), w kolejnych pokoleniach klonu gospodarza (wysoka stabilność strukturalna i segregacyjna wektora), • możliwością selekcji i identyfikacji rekombinantów • względnie łatwą izolacją z organizmu gospodarza.

14. Wektory do przygotowywania bibliotek genomowego DNA • Biblioteka genów w tych wektorach sporządzana jest losowo a efektywność jej tworzenia zależy od zoptymalizowania następujących procesów: • częściowego trawienia DNA genomu enzymem restrykcyjnym, • frakcjonowania DNA, w celu wyodrębnienia fragmentów w określonym zakresie wielkości, • wprowadzaniu zrekombinowanych wektorów do określonych komórek gospodarza. Okazuje się, że ten ostatni etap stanowi najistotniejszy problem.

15. Wektory do przygotowywania bibliotek genomowego DNA • Biblioteki fragmentów DNA genomów poszczególnych organizmów konstruowane są w oparciu o bardzo różne systemy do klonowania. • Trudno jest wskazać jednoznacznie na jeden najlepszy system. Jedne z nich wykorzystywane są do wykonania wstępnej mapy fizycznej (ang. low resolution physical map) inne są konieczne do precyzyjnej analizy ułatwiając wykonanie mapy genetycznej (ang. high density physical map).

16. Spośród wektorów z pierwszej grupy zadań czołową rolę odgrywają tzw. sztuczne chromosomy. • Sztuczny chromosom bakteryjny - BAC (bacterial artificial chromosome) • Sztuczny chromosom oparty na replikonie bakteriofaga P1 - PAC (P1derived artificial chromosome), • Sztuczny chromosom drożdżowy - YAC (yeast artificial chromosome).

17. Wektory do przygotowywania bibliotek genomowego DNA • Wektory te zostały nazwane sztucznymi chromosomami z racji: • porównywalnej z nimi liczbie kopii (1- 2) oraz • stosunkowo dużej pojemności insercyjnej dla długich fragmentów DNA, maksymalnie 300 kpz dla BAC i PAC oraz 1400 kpz dla YAC.

18. Wektory do przygotowywania bibliotek genomowego DNA • Podobnie jak w przypadku naturalnych chromosomów replikują się wiernie i są stabilnie przekazywane komórkom potomnym. • Poszczególne rodzaje sztucznych chromosomów różnią się stopniem złożoności, co pozostaje w ścisłym związku z pochodzeniem elementów genetycznych je tworzących oraz rodzajem organizmu, w którym są utrzymywane. • Tylko YAC może być uznany za strukturalny minichromosom. Jest liniową cząsteczką DNA, posiada autonomiczne origin replikacji, centromer i telomery.

19. Wektory do przygotowywania bibliotek genomowego DNA • Podstawowymi elementami funkcjonalnymi w przypadku BAC są elementy kontroli oraz regulacji replikacji i segregacji pochodzące z episomu F E. coli. • Dla PAC będą to ori plazmidowy i lityczny bakteriofaga P1 E. coli oraz system do pozytywnej selekcji rekombinantów.

20. Wektory do przygotowywania bibliotek genomowego DNA • Niewątpliwą zaletą wektora YAC jest możliwość wprowadzania nawet bardzo długich insertów DNA (od 100 do 2000 kpz). Niestety często prowadzi to do powstawania chimer, insertów powstałych z połączenia z dwóch lub większej ilości fragmentów DNA, nie sąsiadujących ze sobą na genomie. Stwarza to poważne problemy interpretacyjne podczas analizy struktury genomu. • Kolejną istotną słabością tego systemu jest trudność izolacji YAC spośród innych chromosomów drożdżowych oraz mało wydajna transformacja komórek drożdżowych zrekombinowanym wektorem.

21. Wektory do przygotowywania bibliotek genomowego DNA • Drugą grupę wektorów stanowią systemy klonowania heterologicznego DNA w komórkach E. coli, łączące w sobie cechy plazmidowego wektora i systemu do pakowania w główki bakteriofagów (obecność elementów cosN lub pac). • Wielkość klonowanego fragmentu DNA ograniczana jest pojemnością główki faga. • Zrekombinowane DNA przenoszone jest do komórek metodą transdukcji, której towarzyszy recyrkularyzacja w komórce bakterii.

22. Wektory do przygotowywania bibliotek genomowego DNA Do wektorów tej grupy należą: • kosmidy, wysokokopijne plazmidy oparte na replikonie ColE1 lub pMB1, zawierające sekwencję cosN, rozpoznawaną w procesie pakowania DNA in vitro w główki bakteriofaga l; • fosmidy, udoskonalone pochodne kosmidów, zachowujące ich cechy z wyjątkiem rodzaju replikonu, który w tym przypadku pochodzi z plazmidu F, co obniża ich liczbę kopii do 1-2, • pacmidy, zawierające sekwencję pac, istotną podczas pakowania DNA w główki bakteriofaga P1, sekwencję loxP, istotną do po-transdukcyjnej Cre-zależnej cyrkularyzacji wektora, oraz dwa alternatywne replikony P1, plazmidowy (niskokopijny, 1-2 kopie), do stabilnego utrzymywania wektora i lityczny (wysokokopijny, 10-20 kopii), do amplifikacji wektora. System zaopatrzono ponadto w element pozytywnej kontroli rekombinantów, w postaci genu sacB. którego produkt powoduje efekt letalny bakterii rosnących na podłożu z 5% sacharozą.

23. Ogromną zaletą tych systemów jest bardzo wydajny sposób wprowadzania DNA do komórek bakteryjnych gospodarza, ale ich ograniczeniem jest maksymalna wielkość fragmentu DNA możliwa do upakowania w główce: 45 kpz dla faga l i 100 kpz dla P1. Z racji podwyższonej liczby kopii kosmidów, wektory te uważa się za niestabilne strukturalnie (35% rekombinacji), co zostało w dużej mierze już wyeliminowane w fosmidach.