Kap 10. Rekonstruksjon av Genomet

1. Kap 10.Rekonstruksjon av Genomet Gjennom genetisk og molekyl�r analyse

2. Oversikt over kap.10 Utfordringer og strategier ved genomanalyse Genomst�rrelse Egenskaper m� ogs� analyseres Problemer med DNA polymorfismer Utvikling av hel-genom kart Innsikt kommer fra fullstendig genomsekvensering Antall og type gener Grad av repeterte sekvenser Genom organisering og struktur Evolusjon og lateral genoverf�ring H�yeffektive verkt�y for � analysere genomer og deres proteinprodukter DNA sekvensatorer DNA arrays (mikromatriser) Massespektrofotometere

3. Genomene til levende organismer varierer enormt i st�rrelse

4. Genomikere ser p� to hovedtrekk ved genomer: sekvens og polymorfisme Hovedutfordring � bestemme sekvensen til hvert kromosom i genomet og identifisere mange polymorfismer Hvordan kan man sekvensere et 500 Mb kromosom med 600 bp p� en gang? Hvor n�yaktig skal en genomsekvens v�re? DNA sekvenseringsfeil er p� omkring 1% per 600 bp Hvordan kan en skille sekvensfeil fra polymorfismer? Forekomst av polymorfismer i diploide humane genomer er omkring 1 av 500 bp Gjentatte sekvenser kan v�re vanskelige � plassere Uklonbart DNA kan ikke sekvenseres Opp til 30% av genomet er heterokromatisk DNA som ikke kan klones

5. Splitt og overvinn strategien im�tekommer de fleste utfordringer Kromosomer blir brutt ned i sm� overlappende biter og klonet Endene til klonene blir sekvensert og satt sammen til de opprinnelige kromosomtr�dene Hvert stykke blir sekvensert mange ganger for � redusere feilmarginen 10-gangers sekvensdekning gir en feilmargin p� mindre enn1/10 000

6. Figure 10.2Figure 10.2

7. Teknikker for kartlegging og kloning Kloning Bibliotek med DNA fragmenter p� 500 � 1,000,000 bp Innskudd inn i diverse vektorer Hybridisering Lokalisering av spesielle DNA sekvenser innen biblioteket av fragmenter PCR oppformering Direkte oppformering av et spesielt omr�de som spenner over fra 1 bp to > 20kb DNA sekvensering Automatisert DNA sekvensering som bruker Sanger metoden, bestemmer sekvenser p� opptil 600 bp p� en gang Dataassistert verkt�y Programmer for � identifisere sammentreff mellom en spesiell sekvens og en stor populasjon av tidligere sekvenserte fragmenter Programmer for � identifisere overlapp av DNA fragmenter Programmer fro � estimere feilmargin Programmer for � identifisere gener i kromosomale sekvenser

8. Lage storskala koblingskart Typer av DNA polymorfismer brukt til storskala kartlegging Single nukleotide polymorfismer (SNPs) � 1/500 � 1/1000 bp gjennom genomet Enkle (Simple) sekvens repetisjoner (SSRs) � 1/20-1/40 kb gjennom genomet 2-5 nukleotides blir repetert 4-50 eller flere ganger De fleste SNP'er og SSR'er har liten eller ingen effekt p� organismen Fungerer som DNA mark�rer gjennom kromosomene M� v�re i stand til � raskt identifisere og analysere populasjoner fra 100vis til 1000vis av individer Figure 10.3Figure 10.3

9. Genetiske mark�rer identifiserer hele genomer De f�rste genetiske kart brukte SSR'er som er h�yt polymorfe Identifisert ved screening av DNA biblioteker med SSR prober Oppformert ved PCR og lengde- forskjeller analysert SNP'er � millioner flere i det siste identifisert ved sammenligning av ortologe omr�der av cDNA kloner fra ulike individer

10. Homologer � gener med tilstrekkelig sekvenslikhet til � v�re beslektet til en viss grad i evolusjonshistorien Ortologer � gener i to forskjellige arter som oppsto fra det samme genet i de to artenes felles stamfar Paraloger � oppsto ved duplisering innen sammen art Ortologe gener er alltid homologe, men homologe gener er ikke alltid ortologe

11. SNP�er og SSR�er ved genom dekning Inntil nylig ble kart konstruert fra omkring 500 SSR�er jevnt spredd tvers gjennom genomet (1 SSR for hver 6 Mb) SNP�er gir mer enn 500,000 DNA mark�rer tvers gjennom genomet

12. Typing av genetiske mark�rer over hele Genomet To � trinns analyse for enkle sekvens repetisjoner PCR oppformering St�rrelses separasjon Figure 10.4Figure 10.4

13. Langtrekkende fysiske kart: karyotyper og genomiske bibliotek posisjonerer mark�rer p� kromosomene Fysiske kart Overlappende DNA fragmenter ordnet og orientert over hele spennet av kromosomene Basert p� direkte analyse av DNA istedet for rekombinasjon som koblingskart er basert p� Kartlegger virkelig antall bp, kb, eller Mb som skiller et lokus fra sine naboer Koblings- kontra fysiske kart 1 cM = 1 Mb i mennesker 1 cM = 2 Mb i mus

14. Vektorer brukt til � klone store inskudd til fysisk kartlegging YAC�er (yeast artificial chromosomes) Innskudd st�rrelse 100-1,000,000 Mb BAC�er (bacterial artificial chromosomes) Innskudd st�rrelse 50 � 300 kb Mer stabile og lettere � rense fra verts DNA enn YAC�er

15. Hvordan bestemme rekkef�lgen av kloner gjennom genomet Overlappende innskudd hjelper til med � sette sammen klonede fragmenter Ovenfra og ned tiln�rming� innskudd blir hybridisert mot karyotype av hele genomet Nedenfra og opp tiln�rming � overlappende sekvenser av titusenvis av kloner bestemmes ved restriksjonsseteanalyse eller sekvens- merkede (tag) seter (STS�er)

16. Human Karyotype (a) Fullstendig sett med humane kromosomer farget med Giemsa fargestoff viser b�nd (b) Ideogrammer viser idealiserte b�ndm�nstre Figure 10.5 aFigure 10.5 a

17. Kromosom 7 ved tre oppl�sningsniv�er Figure 10.5 bFigure 10.5 b

18. FISH protokoll for ovenfra og ned tiln�rming Figure 10.6Figure 10.6

19. DNA hybridisering og restriksjonskartlegging � en nedenfra og opp tiln�rming Figure 10.7Figure 10.7

20. Identifisering og isolering av ett sett med overlappende fragmenter fra et bibliotek To tiln�rminger Koblingskart brukes til � utvikle fysiske kart Sett av mark�rer mindre enn1 cM fra hverandre Bruk mark�rer til � gjenfinne fragmenter fra biblioteker ved hybridisering Konstruer kontiger � to eller flere delvis overlappende klonede fragmenter Kromosomvandring ved � bruke ender av usammenhengende kontiger til � probe fragmenter i ukartlagte omr�der Fysiske kartleggingsteknikker Direkte analyse av DNA Overlappende kloner settes sammen ved restriksjonskartlegging Sekvens merkede (tagged) segmenter (STS�er)

21. H�yoppl�selig koblings kartlegging til � bygge overlappende sett av genomiske kloner Figure 10.8Figure 10.8

22. Fysisk kartlegging av overlappende genomiske kloner uten koblingsinformasjon Figure 10.10Figure 10.10

23. Fysisk kartlegging ved analyse av STS�er Figure 10.11Figure 10.11

24. Sekvenskart viser rekkef�lgen av nukleotider i et klonet stykke DNA To strategier for � sekvensere det humane genom Hierarkisk shotgun tiln�rming Hel-genom shotgun tiln�rming Shotgun � tilfeldig genererte overlappende innskutte fraagmenter Fragmenter fra BAC�er Fragmenter fra oppkutting av hele genomet Oppkutting av DNA ved sonikering Delvis ford�ying med restriksjonsensymer

25. Hierarkisk shotgun strategiBrukt av den offentlig st�ttede innsats for � sekvensere det humane genom Kutt 200 kb BAC kloner i ~2 kb fragmenter Sekvenser endene 10 ganger N�dvendig med omkring 1700 plasmid innskudd per BAC og omkring 20,000 BAC�er for � dekke genomet Data fra kobling og fysiske kart brukes til � sette sammen sekvenskart av kromosomene Betydelig arbeid i � lage bibliotek av hver BAC og fysisk kartlegge BAC kloner Figure 10.12Figure 10.12

26. Hel-genom shotgun sekvenseringBrukt av det private firma Celera til � sekvensere hele det humane genom Hel-genom tilfeldig kuttet tre ganger Plasmid bibliotek konstruert med ~ 2kb innskudd Plasmid bibliotek ~10 kb innskudd BAC lbibliotek med ~ 200 kb innskudd Dataprogram setter sammen sekvenser inn i kromosomer Ingen fysisk kartkonstuering Bare et BAC bibliotek Overvinner vanskelighetene med repeterte sekvenser Figure 10.13Figure 10.13

27. Begrensninger ved hel-genom sekvensering Noe DNA kan ikke klones F.eks. heterokromatin Noen sekvenser omarrangeres eller opprettholder delesjoner n�r de klones Fremtidig stor-genom sekvensering vil bruke begge typer shotgun tiln�rming

28. Sekvensering av det humane genom Det meste av prosessen skjedde il�pet av det siste �ret av prosjektet Instrumentforbedringer � 3545,600 bp/dag Automatisert fabrikkmessig produksjonslinje skaffet tilstrekkelig DNA til � forsyne sekvensatorene daglig Store sekvenseringssentra med 100-300 instrumenter � 103,680,000 bp/dag

29. Integrering av koblings-fysiske- og sekvenskart Gir en kontroll av den riktige rekkef�lgen av hvert kart mot de to andre SSR og SNP DNA koblingsmark�rer ble raskt integrert inn i fysiske kart ved PCR analyser gjennom innsatte kloner i fysiske kart SSR, SNP (koblingskart), og STS mark�rer (fysiske kart) har unike sekvenser p� 20 bp eller mer og tar hensyn til plassering p� sekvenskart

30. Forandringer i biologi, genetikk og genomiks fra den humane genomsekvens Genetikkens viktige punkter s� langt Fremskynder gen-finning og gen-funksjons analyse Sekvensidentifisering i andre organismer gjennom homologi Gen funksjon i en organisme hjelper til med � forst� funksjon i en annen med hensyn p� ortologe og paraloge gener Gener koder ofte for ett eller flere protein domener Tillater gjetning p� funksjon av nye proteiner ved sammenligning av protein sekvenser i databaser over alle kjente domener Rask tilgang til identifisering av kjente humane polymorfismer Fremskynder kartlegging av nye organismer ved sammenligning F-eks. Mus og mennesker har h�y likhet i geninnhold og rekkef�lge

31. Hvordan transkripsjonsfaktor-proteindomener har utbredd seg i spesielle slekter Figure 10.14Figure 10.14

32. Konserverte segmenter i sammensatte blokker i humane og muse-genomer Figure 10 10.15Figure 10 10.15

33. Hovedinnsikt fra human- og modellorganismesekvenser Omkring 40,000 humane gener Gener koder for ikke-kodende RNA eller proteiner Repeterte sekvenser utgj�r > 50% av genomet Tydelige typer av genorganisering Kombinasjonsstrategier gir �ket genetisk informasjon og �ker mangfoldet Evolusjon ved lateral overf�ring av gener fra en organisme til en annen Menn har dobbelt s� h�y mutasjonsgrad som kvinner Humane raser har veldig f� unike kjennetegnende gener Alle levende organismer stammer fra en felles stamfar

34. Gjenst�ende sp�rsm�l omkring det Humane Genomet Vanskelig � presist ansl� antall gener p� n�v�rende tidspunkt Det fullstendige genom er ikke n�yaktig sekvensert Sm� gener er vanskelige � identifisere Noen gener blir sjelden uttrykt og har ikke normalt kodon bruksm�nster � derfor vanskelige � p�vise

35. Ikke-kodende RNA gener Transport RNA�er (tRNAs) � tilretteleggere som oversetter triplett koder fra RNA til aminosyresekvenser av proteiner Ribosomal RNA�er (rRNAs) � komponenter av ribosomet Small nucleolar RNA�er (snoRNAs) � RNA bearbeiding og basemodifisering i kjernen Small nuclear RNA�er (sncRNAs) - spleisosomer

36. Protein kodende gener danner proteomet Proteome � kollektiv translation av 30,000 proteinkodende gener over i proteiner Kompleksiteten i proteomet �ker fra gj�r til mennesker Flere gener Lurere kobling, �kning eller minsking av funksjoneller moduler Flere paraloger Alternativ RNA spleising � mennesker innehar betydelig mer Kjemisk modifikasjon av proteiner er h�yere i mennesker

37. Repeterte sekvenser faller inn i fem klasser Transposon-avledete repetisjoner Bearbeidede pseudogener SSRs Segmentielle duplikasjoner p� 10-300 kb Blokker av repeterte sekvenser ved sentromerer, telomererer og andre kromosomale s�rtrekk

38. Gen organisering av genomet Gen familier N�rt beslektede gener gruppert eller spredd Gen-rike omr�der Funksjonelle eller tilfeldige hendelser? Gen �rkener Utgj�r 144 Mb eller 3% av genomet Inneholder regioner som er vanskelige � identifisere? F.eks store gener � nukle�re transkripter utgj�r 500 kb eller mer med veldig store introns (exons < 1% of DNA)

39. Lateral overf�ring av gener > 200 humane gener kan ha oppst�tt ved overf�rsel fra organismer som bakterier Lateral overf�rsel er direkte overf�rsel fra gener fra en art til kj�nnscellene til en annen

40. Dobbelt s� h�y mutasjonsgrad i menn Sammenligning av X og Y kromosomer Det samme kan v�re tilfelle i autosomer, men vanskelig � m�le Hovedmengden av humane mutasjoner skjer i menn Menn gir opphav til flere feil, men ogs� mer mangfold

41. Menneskeraser har tilsvarende gener Genom sekvenssentra har sekvensert betydelige deler av minst tre raser Variasjonsbredden av polymorfismer innen en rase kan v�re mye st�rre enn variasjonsbredden mellom to individer av forskjellig rase Veldig f� gener er rasespesifikke Genetisk er mennesker en enkelt rase

42. Alle levende organismer er en enkelt rase Alle levende organismer har bemerkelses- verdige like genkomponenter Livet oppstod en gang og vi er etterkommere av den hendelsen Analyse av passende biologiske systemer i modellorganismer gir grunnleggende innsikt i de tilsvarende humane systemer

43. H�yeffektive instrumenterDNA sekvensator Figure 10.23Figure 10.23

44. H�yeffektive instrumenter eks, mikromatriser (arrays) Figure 10.24Figure 10.24

45. Figure 10.25Figure 10.25

46. Massespektrometer Figure 10.27Figure 10.27

47. Sosiale, etiske, og rettslige sp�rsm�l Privatisering av genetisk informasjon Begrensninger ved genetisk testing Patentering av DNA sekvenses Samfunnets syn p� eldre mennesker Oppl�ring av leger Human genetisk ingeni�rkunst Somatisk gen terapi � innsetting av erstatningsgener Kj�nnscelle terapi � modifikasjon p� de humane kj�nnsceller