A ghrelin kardiovaszkuláris hatásainak vizsgálata

1. A ghrelin kardiovaszkuláris hatásainak vizsgálata Dr. Sax Balázs A molekulától a betegágyig, a sejttől a szervezetigPhD-kurzus, 2012.04.16.

2. Ghrelin • a növekedési hormon elválasztását serkentő receptor (GHS-R) endogén ligandja • 28 aminosav • aktív formájá: Ser3 octanoil csoport (GOAT enzim) • keringő ghrelin 90%-a dezacilált (inaktív?) • elsősorban a gyomorban termelődik, de mRNS-e és receptora többféle szövetben megtalálható (pl. érendotél, szívizomszövet) • két receptor-altípus létezik:GHS-R1a (GPCR 7 TM) GHS-R1b (GPCR 5 TM)

3. Ghrelin mRNS kópia szám Ghrelin szöveti expresszió • Legmagasabb kópiaszámban: Gyomor fundus Vékonybél Tüdő Pankreász Vese Vastagbél Hipothalamus • Alacsonyabb kópiaszámban: Limfocita Szívizomszövet ( Gnanapavan et al. 2002 )

4. GHS-R 1a mRNS kópiaszám GHS-R1a szöveti eloszlás • Hipofízis • Hasnyálmirigy • Pajzsmirigy • Lép • Szívizomszövet ( Gnanapavan et al. 2002 )

5. GHS-R 1b mRNS kópiaszám GHS-R1b szöveti eloszlása • Bőr • Szívizomszövet • Hipofízis • Pajzsmirigy • Hasnyálmirigy • Vékonybél • Vastagbél • Máj • Emlő • Lép • .... ( Gnanapavan et al. 2002 )

6. Agy Étvágy Hipofízis Növekedés Növekedési hormon Kardio-vaszkuláris rendszer Neuroendokrin sejt Metabolizmus www.phoenixpeptide.com A ghrelin hatásai • Központi idegrendszeri hatások • növekedési hormon elválasztásának serkentése • táplálékfelvétel serkentése • bélmotilitás fokozása (n. vagus) • gyomorsav-termelés • Metabolikus hatások • zsírraktárak növelése • negatív korreláció az inzulinszinttel és a BMI-vel • Kardiovaszkuláris hatások

7. Kardiovaszkuláris hatások: • pertérfogatot és a verővolumen növelése • pumpafunkció javítása krónikus szívelégtelenségben • vérnyomás csökkentése (centrális és perifériás mechanizmus) • kardioprotektív hatások: • ischaemia-reperfúzióban csökkenti az infarktusméretet • csökkenti az oxidatív stressz mértékét • antiinflammatorikus hatás • antiaritmiás hatás • gátolja a szívizomsejtek apoptózisát • serkenti az angiogenezist • kétirányú érhatások

8. Vizsgálatok • Szívizom ghrelintermelésének vizsgálata ischaemiás szívbetegségben • Ghrelin direkt koronáriahatásának vizsgálata izolált kutya arteriolákon

9. Perikardiális folyadék ghrelintartalmának vizsgálata ischaemiás és non-ischaemiás szívbetegségben • A ghrelin plazma és perikardiális koncentrációinak jellemzése iszkémiás (CABG) és nem iszkémiás (billentyűműtétre kerülő) betegcsoportokban. • A ghrelinkoncentráció és egyes metabolikus és funkcionális kardiológiai paraméterek összefüggésének vizsgálata.

10. Perikardiális folyadék • eredetét tekintve főként miokardiálistranszszudátum • több szíveredetű ágens a a plazmánál magasabb koncentrációban van jelen (pl. ET-1, ANP, adeninnukleozidok) • ischaemiás szívbetegségben ezen anyagok koncentrációja (pl. adeninnukleozidok) tovább emelkedhet • ezen magas lokális koncentrációban jelen lévő ágensek visszahathatnak a szívműködésre

11. Mintavétel és módszer • intraoperatív perikardiális folyadék (PF) mintavétel és egyidejű centrális vénás vérvétel • aktív (acilált) és összes (acilált + dezacilált) ghrelin meghatározás (RIA), inzulin mérés (ELISA), echokardiográfiás és egyéb laboratóriumi paraméterek * p<0,05 BILL vs. ISCH

12. Aktív és összes ghrelin koncentráció a plazmában és perikardiális folyadékban • magasabb perikardiális aktív ghrelin szint ischaemiás szívbetegségben • perifériás ghrelin szintek között nincs különbség • magasabb PF/plazma ghrelin arány az ISCH betegekben • fokozott myocardialisghrelin-termelés ISCH szívbetegségben * BILL vs. ISCH p<0,01 # PF vs. plazma p<0,01

13. Korreláció echokardiográfiás paraméterekkel • A perikardiális ghrelin szint a septummal nem, csak a bal kamrai hátsó fallal mutat összefüggést, ami a szabad kamra fal ghrelintermelő szerepére utalhat. • A bal kamrai izomtömeggel talált összefüggés hátterében vélhetőleg a BMI-vel mutatott negatív összefüggés áll.

14. Korreláció metabolikus paraméterekkel • A plazma összghrelin negatív korrelációja a testtömegindexszel és az inzulinrezisztenciával az irodalomból ismert összefüggés. • A perikardiális ghrelin szintek összefüggése a plazma inzulinszinttel és az inzulinrezisztenciával felveti a szénhidrátháztartás szabályozó szerepét a lokális ghrelintermelődésben.

15. Következtetések • Az emelkedett perikardiális ghrelin szint a krónikusan ischaemiásmyocardium fokozott ghrelintermelésére utal. • Az echokardiográfiás és metabolikus paraméterekkel talált korrelációk a szabad kamrafal szerepére utalnak a perikardiális ghrelin termelődésében, valamint felvetik a széhidrát-háztartás szabályozó szerepét is. • A ghrelin sokrétű kardioprotektív szerepét figyelembe véve az észlelt fokozott ghrelintermelődés a krónikusan iszkémiás szívizom önvédő mechnizmusának része lehet.

16. A ghrelin direkt érhatásának vizsgálataizolált kutya koronáriaarteriolákon

17. Szerző Faj/modell Prekontrakció Nagaya et al. 2001 humán / iv. infúzió - MAP esés - Shinde et al. 2005 patkány/ iv. bolus - MAP esés - Okumura et al. 2002 humán / a. brachialis infúzióalkari véráramlás növekedés - ÉRTÁGULAT Wiley et al. 2002 humán / arteria mammaria gyűrű szuperfúzió 10 nM endotelin-1 Kleinzet al. 2006 humán / arteria mammaria gyűrű szuperfúzió 10 nM endotelin-1 Grossiniet al. 2007 malac/ intrakoronáriás bolus - Dimitrovaet al. 2006 tengerimalac/ vese artéria gyűrű szuperfúzió 10 nM endotelin-1 ÉRÖSSZEHÚZÓDÁS Dimitrova2007 humán / izolált mezenteriális artéria szuperfúzió 5-10 nM endotelin-142 mM KCl Pemberton etal. 2004 patkány/ izolált szív és izolált koronária arteriola -

18. Célkitűzések • A ghrelin receptor altípusok (GHS-R1a, GHS-R1b) jelenlétének vizsgálata kutya koronária ereken. • A ghrelin koronária arteriolákra kifejtett hatásának vizsgálata spontán és emelkedett értónus mellett. • A GHS-R1a szerepének vizsgálata az érválasz létrejöttében.

19. GHS-R1a 44 kDa GHS-R1b 32 kDa 250kDa 130kDa 250kDa 100kDa 130kDa 70kDa 100kDa 55kDa 70kDa 55kDa 35kDa 27kDa 35kDa 15kDa 27kDa A ghrelin receptorok vizsgálata immunhisztokémiával kutya koszorúereken • primer antitest: nyúlban termelt humán GHS-R1a, GHS-R1b elleni antitestek • detektálás: - biotinilált szekunder antitest - avidin-biotinperoxidáz komplex (ABC) - kromogénként diaminobenzidin (DAB) - háttérfestés hematoxylinnal • pozitív kontroll: kutya hipotalamusz GHS-R1a, GHS-R1b pozitív sejtek • negatív kontroll: elsődleges antitest elhagyása • antitestek validálása Western blot technikával

20. GHS-R1a immunpozitivitás a c b f e d Kutya hipotalamusz Kutya hipotalamusz g h i

21. a c b GHS-R1b immunpozitivitás f e d Kutya hipotalamusz Kutya hipotalamusz g h i

22. A ghrelin érhatásának vizsgálata izoláltintramuráliskoronáriaarteriolákon Inkubáció: - normál Krebs- Ringer oldat (nKR) - pH 7,4; 37oC - buborékoltatás:5%CO2, 20%O2, 75% N2 - 50 Hgmm-es intralumináris nyomásszervopumpákkal - endotél funkció (teszt: 10 µM Ach) Intramurális koronária arteriola izolálás, kanülálásegészséges kutyaszívből(belső átmérő: 210±16 µm) Átmérőváltozás mérése mikroangiometria

23. Tromboxán analóg A n=8 1 mMU46619 nKR 30 nM GHR 100 nM GHR 300 nM GHR 30 nM GHR 100 nM GHR 300 nM GHR nKR 20 min GHS-R1a receptor specifikus blokkolószere B n=8 1 mM U46619 + 50 mM D-Lys3-GHRP-6 1 mMU46619 30 nM GHR 100 nM GHR 300 nM GHR 30 nM GHR 100 nM GHR 300 nM GHR nKR 20min Protokoll

24. Ghrelin hatása az érátmérőre izolált koronária arteriolákon * p<0,05, **p<0,01 normál tónus vs. U46619-prekontrakció (Student-féle egymintás t-próba), átlag±SEM

25. Ghrelin hatása az érátmérőre GHS-R1a receptorblokádban izolált koronária arteriolákon

26. Következtetések • A GHS-R1a és GHS-R1b receptorok jelen vannak a kutya koronária arteriolák falában. • A ghrelin kutya koronária arteriolákon megemelt tónus eseténérszűkítő hatással bír. • Bár a receptor jelen van az érfalban, a vazokonstriktor válasznem a GHS-R1aaktivációján keresztül jön létre - annak hátterében más receptoriális mechanizmus állhat.

27. Lehetséges receptoriális mechanizmusok • CD36 receptor(koronária szűkület ghrelin analógra, Bodart et al. 2007) • GHS-R1b receptor • 5-HT2a receptor (bél simaizom kontrakció GHRP-származékra,Depoortere et al. 2006)

28. Ghrelin CD 36 Ca PKC CD36 A CD36 közvetíti a ghrelin analóg hexarelin koronária perfúziós nyomást növelő hatását patkány izolált szív modellen. (Bodart et al. 2002) • Scavenger receptor, sejtfelszíni fehérje • Szöveti eloszlása: zsírszövet, vérlemezke, mikrovaszkuláris endothel sejtek, monocita/macrofág, miokardium • Szerepe: zsír metabolizmus, haemostasis, thrombosis, atherogenesis, gyulladás • Lehetséges jelátvitel: PKC és L-típusú kalcium csatorna aktiválás

29. KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!