LA PHOTOTRANSDUCTION Certificat « organes des sens » 2005-2006 S. ALLOUCHE

1. LA PHOTOTRANSDUCTIONCertificat « organes des sens »2005-2006S. ALLOUCHE

2. RAPPELS • L’œil reçoit la lumière (entre par pupille, est focalisée sur rétine par cristallin) • Il est capable de l’absorber et de la transformer en énergie électrique (par l’intermédiaire des cellules en cône et en bâtonnet de la rétine) • Ce signal électrique est ensuite via le nerf optique transmis au cerveau qui reconstitue l’image • Ceci nécessite une coordination entre l’œil et le cerveau

3. Emission de rayons lumineux à partir d’un objet. Ces rayons sont focalisés sur la rétine et forme une image inversée • Sur la rétine, les cellules photoréceptrices qui absorbent la lumière sont alors activées • Les cellules photoréceptrices envoient alors un signal électrique via le nerf optique jusqu’au cerveau dans le cortex visuel • Ces signaux électriques reçus sont alors « décodés » et une image est alors reconstruite. • Il y a ensuite une interprétation de cette image reconstruite.

4. Comment se passe la transmission entre le signal lumineux et le signal électrique ? • C’est au niveau des cellules photoréceptrices présentes dans la rétine que se fait cette transformation de signal lumineux en signal électrique • La rétine • Elle est constituée d'une fine membrane transparente qui tapisse toute la surface du fond de l'œil et contient les cellules photo-réceptrices (sauf au niveau de la tâche aveugle) • Sa structure : il y a donc plusieurs niveaux de cellules. • une couche des cellules photo-réceptrices : les cellules en bâtonnet et les cellules en cône (nommées ainsi de part leur forme). • les neurones bipolaires constituent une nouvelle couche. En moyenne, 5 à 20 cellules visuelles sont en relation avec un neurone bipolaire • 5 à 10 neurones bipolaires sont en relation avec un neurone ganglionnaire (un million dans la rétine) dont les axones constituent les fibres du nerf optique • • La lumière doit d’abord passer à travers les différentes couches de neurones avant d’atteindre les cellules photo-réceptrices

5. La rétine • -l’épithélium pigmenté (mélanine) a plusieurs rôles: • évite le reflet de la lumière vers les cellules photo-réceptrices • Apport de vitamine A

6. Les cellules photo-réceptrices

7. Densité en photorécepteurs dans la rétine centrale 180 000 cônes / mm2 0 bâtonnets Densité en photorécepteurs dans la rétine périphérique 3000 à 4000 cônes / mm2 80 000 bâtonnets / mm2 Diamètre d'un cône 1,5 μm Diamètre d'un bâtonnet 4 μm • • Il y en a environ 110 millions de cellules en bâtonnet dans la rétine humaine. Elles sont surtout présente dans la rétine périphérique et sont renferment la rhodopsine. Rôle dans vision « faible lumière » • les cellules en cône sont au nombre de 6 millions et sont essentiellement présentes dans la fovéa (placée en position diamétralement opposée à la cornée transparente). Chez l'Homme, on a pu y mettre en évidence trois sortes de pigments, différents de la rhodopsine, mais sensibles aussi à la lumière. Rôle dans vision « colorée »

8. Les cellules photo-réceptrices • Dans la région de la fovéa, la liaison synaptique des photorécepteurs avec les bipolaires et les neurones ganglionnaires est approximativement linéaire: chaque cône fovéal dispose ainsi de sa "ligne privée"max. définition des images analysées par les photorécepteurs (le "grain rétinien") mais la luminosité doit être suffisante. • La rétine centrale (fovéale) a donc une excellente acuité  et une faible sensibilité = c’est la vision centrale • Dans la rétine périphérique, plusieurs cellules en bâtonnet convergent vers le même neurone ganglionnaire augmente la sensibilité (faible intensité lumineuse) mais faible résolution.

9. CôNE Segmentinterne Cil connecteur Segmentexterne Les cellules en cône Extrémité synaptique • Les cônes, comme les bâtonnets comprennent deux parties:  - le segment interne, contenant le noyau et les autres organites cellulaires.  - le segment externe, de forme cylindrique est constitué par un empilement de replis membranaires qui portent les pigments photosensibles.  La substance photosensible est constituée par le 11-cis rétinal + un récepteur couplé aux protéine G. C'est un dérivé de la vitamine A, ce qui explique qu'une carence en cette vitamine A (carottes, fruits, etc...) entraîne une diminution considérable de la sensibilité de l'œil aux faibles éclairements (cécité nocturne).

10. Les cellules en cône • Les cellules à cône sont impliquées dans la vision des couleurs • Alors qu’il n’existe qu’un type de cellule photo-réceptrice sensible à la vision monochromatique (cellules en bâtonnet), il y a 3 types différents de cellules à cône • Ces cellules permettent la perception des 3 couleurs fondamentales : • Rouge • Bleu • Vert • • Le chromophore est identique pour ces 3 types de cellules, c’est le 11-cis rétinal • • Ce chromophore est lié à des protéines différentes (la composition en AA du récepteur est quelque peu différente, présence d’AA hydrophiles proches du 11-cis rétinal)  donne des propriétés spectrales distinctes • • La photo-transduction à partir des cellules à cône est identique à celle des cellules à bâtonnet

11. Les cellules en cône

12. 6 millions de cellules en cône impliquées dans la vision des couleurs et dans la forme des images  vision diurne • 110 millions de cellules en bâtonnet impliquées dans la vision monochrome (noir et blanc) mais extrêmement sensibles à la lumière  vision nocturne • Différence de réponse entre cellules en cône et cellules en bâtonnet : plus de sensibilité à la lumière pour cellules en bâtonnet (ex : lorsque l’on passe d’un endroit éclairé à un endroit sombre temps d’adaptation) et photo-réponse plus rapide pour les cellules en cône • La photo-tranduction : c’est une cascade de réactions biochimiques qui se déroulent dans les cellules photo-réceptrices aboutissant à une impulsion électrique au niveau de la synapse terminale qui ensuite sera véhiculée par les autres cellules de la rétine, puis via le nerf optique jusque dans le cerveau ou le signal sera décodé.

13. Extrémité synaptique BATONNET Segmentinterne Cil connecteur Segment externe Les cellules en bâtonnet • Structure : • Long et cylindrique • Un segment externe et un segment interne séparés par un cil connecteur • Dans le segment externe : empilement de disques plats membranaires contenant les photo-récepteurs, les canaux sodiques et calciques • Dans le segment interne : Na/K ATPase, mitochondries (ATP pour la Na/K ATPase), noyau • A l’extrémité : le bouton synaptique Cellules capables de capter signaux lumineux dans bleu-vert (l = 500nm)

14. Les cellules en bâtonnet • Zoom sur le segment externe

15. Les cellules en bâtonnet • Formation des disques membranaires plats contenant les photo-récepteurs • A partir du cil intermédiaire, formation des disques membranaires • Renouvellement régulier par phagocytose niveau de l’épithélium pigmenté

16. Les cellules en bâtonnet : Propriétés électriques • Les cellules photo-réceptrices ont des propriétés électriques différentes des cellules nerveuses « classiques » : • leur potentiel de repos ~ - 30 mV (contre –60 à –90 mV) elles sont dépolarisées • • A l’obscurité, elles vont libérer en continue leurs neurotransmetteurs à l’extrémité synaptique (dont le glutamate) stimulation des autres cellules (bipolaires et ganglionnaires) • • L’absorption de lumière par les cellules photo-réceptrices va conduire à une hyperpolarisation avec un potentiel membranaire de – 35 mV « dark current »

17. Les cellules en bâtonnet : Propriétés électriques • Cette hyperpolarisation s’étend le long de la cellule photo-réceptrice vers l’extrémité synaptique et inhibe la libération de neurotransmetteur • Courants ioniques et dépolarisation / hyperpolarisation Ca2+ Ca2+

18. Les cellules en bâtonnet : Propriétés électriques • A l’obscurité, le courant est lié à l’entrée de Na+et de Ca2+par l’intermédiaire de canaux présents sur le segment externe et à la sortie de K+ au niveau du segment interne (mouvements dictés par gradient de concentration) • Ce gradient ionique est maintenu grâce à la Na+/ K+ATPase (3 sodium contre 2 potassium), échangeur Na+/ Ca2+, K+ • La présence de lumière va déclencher la fermeture de ces canaux ioniques et éviter l’accumulation de charges positives à l’intérieur des cellules photo-réceptrices • La quantité de photon nécessaire au déclenchement de la fermeture des canaux ioniques peut être très faible : • Un seul photon peut provoquer l’hyperpolarisation d’1 mV dans une cellule •  Il existe des mécanismes qui entre l’absorption de la lumière et l’hyperpolarisation vont permettre l’amplification de ce signal : c’est la photo-transduction

19. Les cellules en bâtonnet • La rhodopsine ou le pigment visuel : • Elle est composée : • D’une protéine qui est appelée opsine qui est composée de 7 domaines transmembranaires organisés en hélice alpha. C'est le premier RCPG à avoir été cloné, en 1984, et ce, chez l'homme. Depuis lors, l'ADNc de cette protéine a été cloné chez de nombreuses espèces animales (bovins). • D’un chromophore (c’est une molécule qui va absorber la lumière à une certaine longueur d’onde) qui dans le cas de la rhodopsine est le 11-cis rétinal. Ce chromophore est lié de manière covalente à l’opsine par l’intermédiaire d’une base de schiff. • Le 11- cis rétinal provient du b-carotène qui est métabolisé dans la muqueuse intestinale

20. Les cellules en bâtonnet • Synthèse du 11-cis rétinal : • Sission par oxydation du b-carotène • Transformation rétinal  en 11-cis rétinal • Mise en réserve dans le foie sous la forme ester de vitamine A après réduction du rétinal en rétinol (ou vitamine A1) par la rétinol deshydrogénase. • Après action d’une estérase, la vitamine A se trouve complexée avec une molécule de palmitate. • - Le rétinol sera ensuite acheminé jusqu’à par RBP via l’épithélium pigmenté jusqu’aux récepteurs dans disques membranaires

21. Les cellules en bâtonnet 348 AA 39 kDa 2 chaînes Oligosaccharides extracellulaires 11-cis rétinal

22. Les cellules en bâtonnet • La rhodopsine est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG) un peu particulier, dans le sens où c'est un récepteur associé à son ligand. En effet, une molécule de 11-cis-rétinal est associée de manière covalente à un résidu de lysine du TM VII (296) de l’opsine, et ce, par l'intermédiaire d'une base de Schiff. Ce rétinal est localisé dans la partie supérieure de la poche hydrophobe formée par les segments TM. • La chaîne latérale d'un acide glutamique du TM III constitue le contre-ion qui stabilise le 11-cis-rétinal. D’autres résidus participent aux interactions : Gly 121 (TMIII), Phe 261 et Trp 265 (TM VI).

23. Les cellules en bâtonnet • La liaison covalente du 11-cis rétinal sur l’opsine contribue à maintenir le récepteur dans sa conformation inactive (mutant constitutivement actif quand Lys296Gly) • D’autre part, les régions extracellulaires sont « rigides » et cela va réduire l’activation spontanée du récepteur en absence de lumière intérieur extérieur Vue côté cytoplasmique

24. Les cellules en bâtonnet • Propriétés physico-chimiques du 11-cis rétinal : • Ce chromophore est donc capable d’absorber les photons de la lumière. • Le maximum d’absorbance est obtenu à 380 nm lorsqu’il est à l’état libre et lorsqu’il est fixé sur l’ospine, ce maximum est d’environ 500 nm pour les bovins et de 560 nm pour l’homme.

25. Les cellules en bâtonnet • Lorsque le 11-cis rétinal absorbe les photons, il se produit alors une isomérisation avec le passage à la forme tout-trans rétinal (les électrons vont aller sur des orbitales de plus haute énergie, cela va « casser » la double liaison entre les carbones C11 et 12 du 11-cis rétinal et permettre une libre rotation et l’obtention du tout-trans rétinal). • L’isomérisation ne se produit pas spontanément mais grâce à l’absorption de photons mais pas systématiquement. Cette étape est très rapide < quelques picosecondes (10-12 sec) • Cette isomérisation du chromophore déclenche à son tour l’hydrolyse de la base de schiff entre l’opsine et le rétinal. La forme tout-trans rétinal est alors libérée. • Le récepteur va alors passer dans une conformation active et initier une cascade de réactions biochimiques conduisant à la transmission d’un signal électrique

26. Les cellules en bâtonnet • Isomérisation du 11-cis rétinal en tout-trans rétinal Liaison sur la Lys296 de l’opsine

27. Les cellules en bâtonnet • Etats intermédiaires entre la rhodopsine inactive (11-cis rétinal) et l’opsine sous forme libre : • Ces différents états ont été mis en évidence à basses températures et possèdent des propriétés spectrales distinctes. Citons la bathorhodopsine qui contient le tout-trans rétinal. Parmi ces intermédiaires, seule la métarhodopsine II est la forme active pour la transmission du signal

28. R* Les cellules en bâtonnet

29. Les cellules en bâtonnet rhodopsine bathorhodopsine

30. TRANSDUCINE • La metarhodopsine II qui correspond à l’état activé du récepteur (R*) va stimuler des protéines G qui ne sont uniquement exprimées dans les cellules photo-réceptrices : • les transducines.

31. TRANSDUCINE • Dans la membrane des disques présents dans le segment externe, les récepteurs activés sont mobiles et une molécule de récepteur est capable d’activer environ une centaine de molécules de transducine : c’est une étape d’amplification du signal. • Les transducines sont composées de 3 sous-unités : Ta, Tb et Tg. • Au repos, la transducine existe sous l’état hétérotrimérique. • L’interaction métarhodopsine II (2ème et 3 ème boucle intracellulaire) avec Ta, va catalyser la libération du GDP en permettant un changement de conformation et l’ouverture de la « poche de liaison des nucléotides guanyliques ». Des études par mutagénèse dirigée ont montré que le pont disulfure formé par les Cys 110 et 187 liant le TM III et la 2ème boucle intracellulaire était indispensable à l’activation de la protéine G. Cette interaction fait également intervenir l’extrémité carboxy-terminale du récepteur avec l’extrémité carboxy-terminale de la sous-unités a. • Il en résulte la fixation du GTP sur Ta, qui a son tour provoque la dissociation de l’hétérotrimère en Ta et bg. • Ta-GTP se dissocie de R* et va activer la GMPc-phosphodiestérase

32. TRANSDUCINE

33. TRANSDUCINE

34. Guanylate cyclase et GMPc • La guanylate cyclase est l’enzyme qui permet la production de GMPc à partir du GTP • C’est une protéine oligomérique intégrale de la membrane plasmique • Lors d’un flash lumineux, la concentration en calcium chute de 500 à 100 nM dans la cellule photo-réceptrice : ceci est due à la fermeture des canaux Na+ / Ca2+ GMPc-dépendant et à la [GMPc] via la phosphodiestérase • C’est une protéine dont l’activité est régulée par le calcium via des protéines : GCAP1 et 2. Lorsque les concentrations cytosoliques de calcium diminuent de 500 et 100 nM, l’activité de cet enzyme est multipliée par 5-20. • Ceci stimule la guanylate cyclase qui  [GMPc] • Il se produit alors une ré-ouverture des canaux ionique et une augmentation des concentrations en calcium. • L’activité de la guanylate cyclase est alors réduite

35. Guanylate cyclase et GMPc

36. GMPc-PHOSPHODIESTERASE • A l’obscurité, on retrouve une forte concentration de GMPc dans le segment externe des cellules en bâtonnet. • Ce composé contrôle l’ouverture des canaux ioniques (Na+ et Ca2+ qui rentrent dans la cellule et produisent une dépolarisation des membranes) en se fixant directement dessus extérieur intérieur

37. GMPc-PHOSPHODIESTERASE PDE • La GMPc phosphodiestérase (PDE) est une protéine membranaire composée de 4 sous-unités : • 2 sous-unités catalytiques a et b • 2 sous-unités inhibitrices identiques g • • A l’obscurité, la PDE se trouve à l’état d’hétérotétramère inactif. • • En présence de lumière, une molécule de transducine activée (Ta-GTP) va pouvoir se complexer aux sous-unités g, libérant ainsi les 2 sous-unités catalytiques a et b (activation d’une molécule de PDE) • • la PDE peut hydrolyser plus de 1000 molécules de GMPc / sec

38. GMPc-PHOSPHODIESTERASE • La PDE en abaissant le taux de GMPc cytosolique va provoquer une fermeture des canaux ioniques. • Lorsque les canaux ioniques sont fermés, il se produit une hyperpolarisation des membranes. • Lorsque les canaux ioniques sont ouverts, il y a dépolarisation • C’est l’alternance dépolarisation / hyperpolarisation qui provoque le signal électrique décodé par le cerveau

39. Régulation du signal : La transducine • Suite à la stimulation par la lumière, le système doit revenir dans son état initial : • C’est l’adaptation visuelle • Il existe de nombreux mécanismes de régulation dont le premier se déroule sur la transducine Ta-GTP • Hydrolyse de GTP en GDP par l’activité GTPasique intrinsèque • In vitro, cette activité GTPasique est trop faible pour rendre compte de la vitesse rapide d’inactivation. Deux autres protéines interviennent de manière coordonnée pour accélérer cette activité : • PDE g • RGS 9 (regulatory G-protein signaling)

40. Régulation du signal : La guanylate cyclase (GC) • 2. L’activité de la GC est régulée par le calcium intracellulaire : • A l’obscurité, 500 nM calcium intracellulaire et par l’intermédiaire de protéines qui forment des complexes avec le calcium  inhibition de la guanylate cyclase (fixation directe sur la GC par les protéine calmoduline-like) • Après activation de la rhodopsine, fermeture des canaux ioniques et les concentrations cytosoliques de calcium diminuent à 100 nM levée de l’inhibition et augmentation de l’activité de cet enzyme

41. Régulation du signal GTP 2 GC GMPc 1 3 GMP

42. Régulation du signal : Phosphorylation du récepteur • 3. Les cascades biochimiques de la photo-transduction sont enfin terminées par la phosphorylation de la rhodopsine • Le récepteur activé R* repasse ainsi sous sa conformation inactive R • La phosphorylation est réalisée par la rhodopsine kinase (RK) ou GRK1 (G-protein receptor kinase) qui permet ensuite au récepteur phosphorylé d’interagir avec une autre protéine l’arrestine • Ces mécanismes sont similaires à ceux décrits pour la désensibilisation de la super-famille des récepteurs couplés aux protéines G

43. Régulation du signal : Phosphorylation du récepteur • Premières données sur phosphorylation rhodopsine après flash lumineux datent des années 1970 • Caractérisation de la RK en 1988 par analogie entre la phosphorylation du récepteur b2-adrénergique par la bark et celle de la rhodopsine • Clonage de ces GRK et classification selon leur homologie de séquence : • La Rhodopsine Kinase (RK) ou GRK1 et la GRK7 ou « cone opsin kinase » appartiennent au groupe 1 • Expression de la GRK1 et de la GRK7 à la fois dans les cellules en bâtonnet et en cône

44. GRK et phosphorylation du récepteur

45. GRK et phosphorylation du récepteur • Mécanisme d’activation de la RK par R* (modèle) : • Présence de la RK à l’état inactif • Activation de la rhodopsine par un flash lumineux R  R* • Formation d’un complexe stable R*(état métarhodopsine)-RK et activation de la kinase : rôle des 2ème et 3ème boucles intracellulaires dans l’interaction et l’activation de la RK • Proximité domaine catalytique de la RK et des sites des phosphorylation (dans l’extrémité carboxy-terminale) • La RK pourrait ensuite aller phosphoryler d’autres rhodopsines inactives par diffusion

46. GRK et phosphorylation du récepteur

47. GRK et phosphorylation du récepteur • In vitro, 1 molécule de rhodopsine peut être phosphorylée jusqu’à 9 résidus par la RK • Il existe 3 sites majeurs de phosphorylation : Ser 334, Ser 338 et Ser 343 • In vivo, phosphorylation en premier sur Ser 343 et Ser 338 puis Ser 334 • Il semblerait que plus il y a de phosphorylation (au moins 3), plus le récepteur est inactivé • Conséquences des phosphorylation : • Réduction du couplage aux transducines • Formation d’un complexe R*-P avec l’arrestine (compétition avec Ta)

48. Régénération • Régénération : elle se produit à l’obscurité et va consister en : • 1. La déphosphorylation de l’opsine par des phosphatases • 2. Isomérisation du tout-trans rétinal en 11-cis rétinal + combinaison avec l’opsine (cycle court) • 3. Lorsque la stimulation est intense, réduction du tout-trans rétinal en tout-trans rétinol par une deshydrogénase présente dans le segment externe (cycle long) • Cette forme réduite est alors transportée vers l’épithélium pigmentaire où se trouve une rétinol isomérase et permet le passage tout-trans rétinol 11-cis rétinol. • Action d’une alcool deshydrogénase pour transformer le 11-cis rétinol 11-cis rétinal. Le chromophore va alors pouvoir se complexer de nouveau à l’opsine pour reformer la rhodopsine.

49. Cycle long h Rhodopsine Cycle court Recomposition rapide Passage dans la circulation Régénération Rétinal "trans" + opsine Rétinal "cis" + opsine Rétinol "cis" Rétinol "trans"

50. Résumé