Herstellung von Impfstoffen, Impfungen Antikörper als Therapie Blutgruppen, Rhesusfaktor EliSpot

1. Herstellung von Impfstoffen, Impfungen Antikörper als Therapie Blutgruppen, Rhesusfaktor EliSpot PIA Immun-PCR

2. Impfungen, Herstellung von Impfstoffen • Die Impfung ist eine vorbeugende Maßnahme gegen verschiedene Infektionskrankheiten und wird deshalb auch Schutzimpfung genannt. Man unterscheidet aktive Impfung und passive Immunisierung. Bei einer aktiven Impfung – auch Vakzination genannt – wird der Impfstoff (Vakzine) in Form abgeschwächter, abgetöteter oder fragmentierter Krankheitserreger oder deren Toxine in den Körper eingebracht. Ziel dieser Impfung ist es, das körpereigene Immunsystem zur Bildung spezifischer Antikörper anzuregen und so eine spezifische Immunität gegen die entsprechende Infektionskrankheit zu bewirken. Bei einer passiven Impfung hingegen wird mit Impfserum geimpft, welches die spezifischen Antikörper (Immunglobuline) gegen den betreffenden Krankheitserreger oder dessen Toxin bereits in hoher Konzentration enthält. Es stehen Impfstoffe gegen eine Vielzahl von viralen und bakteriellen Infektionskrankheiten bereit. • Neben der individuellen Immunität des Einzelnen können hohe Durchimpfungsraten zusätzlich zu einer kollektiven Immunität (Herdenimmunität) der Gesamtbevölkerung beitragen, weil je nach Reservoir der entsprechenden Erreger die Zirkulation innerhalb einer Population verringert oder gar gänzlich unterbrochen werden kann. Hierdurch werden dann auch nicht geimpfte Personen (Säuglinge, immundefiziente Patienten u. a.) vor diesen Krankheiten geschützt, obwohl sie selbst nicht dagegen immun sind. Umfassende Impfprogramme haben seit Mitte des 20. Jahrhunderts wesentlich zur Reduktion verschiedener Infektionskrankheiten beigetragen.

4. Neue Impfungen und Entwicklungen • In Europa und den USA sind seit 2006 zwei Impfstoffe gegen Humane Rotaviren, die Erreger schwerer Durchfallerkrankungen bei Säuglingen und Kleinkindern, zugelassen. Die Food and Drug Administration ließ im Frühjahr/Sommer 2006 in den USA einen Impfstoff gegen bestimmte Papillomaviren zu, welche neben Genitalwarzen auch Gebärmutterhalskrebs verursachen. Dieser Impfstoff, der inzwischen in Deutschland zugelassen wurde und in den meisten Ländern Europas schon erhältlich ist, ist somit neben dem gegen Hepatitis B ein weiterer, der auch der Prävention gegen bestimmte Krebsarten dient. • Auch alte Impfstoffe werden beständig weiterentwickelt, um die Reinheit der Produkte zu verbessern und die Ansprechraten zu erhöhen. So werden heute viele Impfstoffe nicht mehr durch chemische Inaktivierung eines Erregers hergestellt, sondern durch Gentechnik lassen sich gezielt bestimmte immunogene Teile eines Erregers produzieren. Durch die gezielte Antigen-Auswahl wird so das Immunsystem eines Patienten trotz größerer Anzahl an verfügbaren Impfstoffen weniger Antigenen insgesamt ausgesetzt. Auch neue Applikationsformen werden entwickelt, beispielsweise die nasale Applikation eines neuen Influenza-Impfstoffs soll besser den natürlichen Infektionsweg imitieren. • Aussichtsreich sind aber auch neue Impfstoffe, beispielsweise gegen Helicobacter pylori, den Haupterreger von Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren, und gegen das Herpes-simplex-Virus, einen Verursacher von Herpes. An verschiedenen Impfstoffen gegen die Tropenkrankheit Malaria wird geforscht. Impfstoffe gegen HIV, Epstein-Barr-Virus (Auslöser des Pfeifferschen Drüsenfiebers), viele Krebs-Arten, weitere Durchfallerkrankungen und viele andere Infektionskrankheiten stehen derzeit noch nicht zur Verfügung. Die Entwicklung solcher Impfstoffe befindet sich noch in einer frühen klinischen Entwicklungsphase

5. Verabreichung von Impfungen • Je nach Impfstoff und Immunisierungsart (passive oder aktive Immunisierung) werden unterschiedliche Applikationsverfahren angewandt: Aktive Impfungen werden parenteral („unter Umgehung des Magen-Darm Traktes“) mit einer Spritze vorgenommen. Man unterscheidet dabei intradermale („in die Haut“), subkutane („unter die Haut“) oder intramuskuläre („in den Muskel“) Injektionen. Die intradermale Impfung kann auch mit einer Lanzette oder einer Impfpistole erfolgen. Für einige wenige Immunisierungen wurde bzw. wird der Impfstoff oral (in den Mund, „Schluckimpfung“) oder nasal (in die Nase) verabreicht. • Die meisten aktiven Impfungen werden jedoch intramuskulär in den Oberarm (Musculus deltoideus) verabreicht. Bei Kindern ist auch eine Injektion in den Oberschenkel (Musculus vastus lateralis) zulässig. Die Injektion von aktiven Impfstoffen in den Gesäßmuskel (Musculus glutaeus maximus) gilt aufgrund geringerer Wirksamkeit und häufigeren Komplikationen laut der STIKO als obsolet. • Passive Immunisierungen hingegen werden häufig in den Gesäßmuskel (Musculus gluteus maximus) verabreicht. • Die Pulverinjektion ist ein in der Entwicklung befindliches Impfverfahren, bei welchem der feste Impfstoff mit hoher Geschwindigkeit in die Epidermis geschossen wird.

6. Aktive und passive Immunisierung

7. Aktive Immunisierung • Die aktive Impfung ist die häufigere Form der Impfung. Bei einer aktiven Impfung werden Lebendimpfstoffe oder Totimpfstoffe eingesetzt. Der Lebendimpfstoff enthält abgeschwächte, noch vermehrungsfähige Erreger, welche die Krankheit nicht auslösen können. Bei einem Totimpfstoff wurden diese Erreger dagegen abgetötet oder er enthält nur noch Bruchstücke des Erregers (Antigene). Es gibt auch Toxoidimpfstoffe, die nur den biologisch inaktiven Bestandteil (Toxoid) des Toxins eines Erregers enthalten (z. B. das Tetanus-Toxoid), die ebenfalls zu den Totimpfstoffen gezählt werden. • Unterschiedliche Lebendimpfstoffe können simultan verabreicht werden. Bei nicht gleichzeitiger Impfung soll der Abstand zwischen zwei Lebendimpfungen allerdings mindestens vier Wochen betragen. Totimpfstoffe oder eine Kombination mit ihnen betrifft dies nicht. Sie können in einen Muskel vornehmlich des Oberarms oder bei Säuglingen des Oberschenkels oder unter die Haut injiziert, geschluckt oder in die Nase gesprüht werden. • Bei der aktiven Impfung wird das Immunsystem zur Bildung einer Immunkompetenz angeregt, ohne dadurch die Erkrankung selbst auszulösen. Eiweißstoffe (Proteine) und Zuckermoleküle oder Kombinationen von beiden der Erreger, sogenannte Antigene, werden von Zellen des Immunsystems als körperfremd erkannt. Die Reaktion des Organismus auf ein unbekanntes Antigen führt zur Bildung von Lymphozyten, welche spezifische Antikörper gegen dieses Antigen produzieren. Nach dieser primären Immunantwort differenzieren diese Lymphozyten zu Gedächtniszellen. Durch die Gedächtniszellen, die weiterhin im Blut und den Lymphbahnen zirkulieren, bleibt der Schutz gegen diese Antigene und somit der Impfschutz lange erhalten. Falls der Körper erneut mit dem Erreger in Kontakt kommt, hat er durch die Gedächtniszellen eine sehr viel effizientere und schnellere Immunantwort zur Verfügung, die die Erreger bekämpft, bevor es zu einer Erkrankung kommt.

8. Toxoid chemische Modifikation Toxin-Teil Antigene Determinanten Modifikation Toxin zu Toxoid Toxin http://pathmicro.med.sc.edu/ghaffar/immunization.htm

9. Passive Immunisierung • Eingeführt wurde die passive Immunisierung 1890 von Emil von Behring, als er ein Heilverfahren gegen Diphtherie entwickelte. Bei der passiven Immunisierung wird der Antikörper direkt gespritzt. Das hat den Vorteil, dass der Organismus nicht erst selbst Antikörper ausbilden muss, was bis zu einer Woche dauern kann. Statt dessen können die in einem Immunserum gespritzten Antikörper die Erreger sofort erkennen und markieren, so dass das Immunsystem des Patienten anschließend auf die Signale der Antikörper reagieren und die Erreger unschädlich machen kann. In der Regel hält eine solche passive Immunisierung nur wenige Wochen bis Monate an, dann sind die „geliehenen“ Antikörper ausgeschieden oder abgebaut und der Organismus ist durch eine neuerliche Infektion durch denselben Erreger wieder gefährdet, da das Immunsystem durch diese Form der schnellen Behandlung nicht stimuliert wurde, ein eigenes Immungedächtnis auszubilden. Aus diesem Grund ist eine passive Immunisierung im Fachterminus auch keine Impfung. Die passive Immunisierung ist daher nur eine Notfallmaßnahme, falls schon ein Kontakt mit dem fraglichen Erreger stattgefunden hat (Postexpositionsprophylaxe). Beispielhaft hierfür ist ein Verdacht auf eine Infektion mit Wundstarrkrampf (Tetanus) oder die Tollwut bei Hundebissen. Wenn ein Patient mit unklarem Impfstatus eine verunreinigte Wunde aufweist, wird er neben der aktiven Impfung eine passive Immunisierung erhalten, um eine Infektion auszuschließen. Eine solche gleichzeitige aktive und passive Immunisierung eines Patienten wird auch als Simultanimpfung bezeichnet. Hierbei spritzt man bei einer Simultanimmunisierung den aktiven und passiven Impfstoff an verschiedenen Körperstellen. Nach Resorption in die Blutbahn neutralisieren die injizierten Antikörper die zirkulierenden Antigene (oder Toxine) und verbleiben gerade solange wirksam, bis die körpereigenen Antikörper als Reaktion auf das andernorts injizierte Antigen (oder Toxoid) aus der aktiven Immunisierung gebildet werden. Man spricht von einem Intervall, welches überbrückt werden soll. • Die verabreichten Antikörper einer passiven Immunisierung werden in der Regel aus menschlichem Blut hergestellt. Aus bis zu 20.000 gepoolten (zusammengegossenen) Blutkonserven werden die Antikörper extrahiert. Das birgt eine gewisse Gefahr für die Übertragung von Krankheiten, insbesondere solcher, deren Übertragungsmodus nicht bekannt ist (z. B. BSE). Auch bekannte Krankheiten (HIV) könnten bei unsachgemäßer Bearbeitung übertragen werden. Neuerdings gibt es auch passive Impfstoffe, bei denen die Antikörper auf gentechnologischem Weg speziell auf einen bestimmten Erreger zugeschnitten in Reinform hergestellt werden (sogenannte monoklonale Antikörper). Hierfür ist beispielhaft die passive Immunisierung mit Palivizumab gegen das Respiratory-Syncytial-Virus (RSV) für gefährdete extreme Frühgeborene mit Lungenerkrankungen zu nennen. • Auch das Gegengift bei Schlangenbissen beruht in der Regel auf dem Prinzip einer passiven Immunisierung. Dieses sogenannte Antivenin wird hergestellt, in dem kleine Mengen eines Schlangengifts in Pferde, Schafe, Ziegen oder Kaninchen injiziert werden. Gegen Proteine im Gift bildet das Immunsystem dieser Tiere spezifische Antikörper, welche aus dem Blut extrahiert werden. Diese Antikörper werden dann Patienten verabreicht. • In ähnlicher Weise wie bei einer passiven Immunisierung sind Neugeborene durch die Mutter-Kind-Immunisierung befristete Zeit gegen einige Infektionskrankheiten geschützt. Unmittelbar nach der Geburt wirken Antikörper, die noch im Mutterleib über die Plazenta aus dem Blut der Mutter übernommen worden sind. Diese „Leih-Immunität“ der Neugeborenen lässt im Laufe der ersten Monate nach der Geburt allmählich nach. Einige Wochen lang nach der Geburt sind Säuglinge auch durch in der Muttermilch vorhandene Antikörper geschützt, sofern die Mutter stillt und diese Antikörper selbst besitzt. Dieser „Nestschutz“ schützt nicht gegen alle Erkrankungen, in erster Linie bietet das Stillen einen Schutz gegen Magen-Darm-Erkrankungen. Die allgemein und in Deutschland insbesondere durch die Ständige Impfkommission (STIKO) empfohlenen Kinder-Impfungen sollen daher so frühzeitig erfolgen, dass keine Lücke in der Erreger-Abwehr entsteht.

10. Nebenwirkungen • Die Nebenwirkungen von Impfungen sind in der Regel so gering, dass sie nicht bzw. nicht als wesentlich wahrgenommen werden. Unterschieden wird dabei zwischen Impfreaktion und Impfkomplikation. • Als sogenannte Impfreaktion werden kurzzeitig und vorübergehende Lokal- und Allgemeinreaktionen bezeichnet. Diese können als temporäre, leichtere Nebenwirkungen Schmerzen, Spannung und Schwellung an der Injektionsstelle, Abgeschlagenheit oder Kopf- und Gliederschmerzen auftreten. In Doppelblind-Versuchen ohne Einwirkung von Erregern, bei denen die eine Hälfte der Freiwilligen den Impfstoff, die andere Hälfte eine Kochsalzlösung oder ein Aluminium-Adjuvans injiziert bekommt, berichten beide Gruppen bei den meisten amtlich empfohlenen Impfstoffen über quantitativ und qualitativ ähnliche Nebenwirkungen: z. B. Schwindel, Kopfschmerzen, Schwächegefühl, Muskelschmerzen. • Eine Impfkomplikation ist dagegen eine über das übliche Ausmaß einer Impfreaktion hinausgehende Komplikation in Folge einer Impfung. Lebendimpfstoffe können in seltenen Fällen zu einem Ausbruch der Krankheit führen, gegen welche geimpft wurde. Zum Beispiel treten bei 3-5 % der Impfungen gegen Masern so genannte „Impfmasern“ auf. Die Nebenwirkungen der Impfung beinhalten dann die Symptome der Krankheit, beispielsweise leichter Ausschlag, Fieber und andere bei Impfmasern, jedoch verläuft diese in der Regel leichter als die „natürliche“ Infektion. In sehr seltenen Fällen kann es auch zu einem allergisch-anaphylaktischen Schock als Reaktion auf die Inhaltsstoffe einer Impfdosis kommen. Neben dem Wirkstoff selber können auch enthaltene Zusatzstoffe wie z. B. Aluminiumverbindungen, Quecksilberverbindungen (Thiomersal), Formaldehyd und Antibiotika oder Stoffe aus der Herstellung des Wirkstoffs wie Hühnereiweiß eine solche Reaktion auslösen.

11. Empfehlungen für D, CH und A

12. Hühnerei-basierte Grippeimpfstoffproduktion • Die Ausgangsviren werden in embryonierte Hühnereier injiziert und die Eier dann bebrütet (inkubiert), während dieser Inkubation vermehrt sich das Virus. Der zukünftige Grippeimpfstoff enthält drei verschiedene Virusstämme, die zunächst getrennt voneinander produziert werden. Da sich jeder Influenzavirusstamm im Wirtssystem Ei unterschiedlich gut vermehrt, kann die Ausbeute bei den einzelnen Grippestämmen sehr unter-schiedlich sein. • Nach der Virusvermehrung werden die Eier geöffnet und die virushaltige Flüssigkeit entnommen. Die zu diesem Zeitpunkt noch infektiösen Influenzaviren werden abgetötet, in Bruchstücke zerlegt und einer Vielzahl von Reinigungs- und Konzentrierungsschritten unterworfen. So wird sicher gestellt, das die später im Impfstoff enthaltenen Viren keine Infektion auslösen können und von möglichen Verunreinigungen befreit sind. Kontinuierlich werden die Produkte der Einzelschritte auf Reinheit kontrolliert. Am Ende werden die drei getrennt voneinander verarbeiteten Stämme zu einem Impfstoff zusammengeführt. Der fertige Impfstoff wird jedes Jahr neu in klinischen Studien auf seine Wirksamkeit und Verträglichkeit geprüft. Erst nach Abschluss der erfolgreichen Prüfung bekommt der Impfstoff eine Zulassung. Danach darf der Impfstoff erst verwendet werden. Ein Hühnerei wird in etwa für die Herstellung einer Dosis des herkömmlichen Grippeimpfstoffes benötigt.

13. Impfstoffproduktion in Zellkultur

14. Antikörper als Therapie • Behandlungsmethode, bei der natürlich gebildete oder gentechnologisch hergestellte Antikörper therapeutisch genutzt werden. So werden bei der passiven Immunisierung in Tieren oder Menschen produzierte Antikörper (Immunglobuline) den Patienten injiziert. Vorteilhaft ist der sofortige Wirkungseintritt, nachteilig die kurze Dauer des Schutzes, die bei tierischen Antikörpern nur 8–14 Tage, bei menschlichen Immunglobulinen einige Wochen beträgt. • In Pferden oder Kaninchen gebildete Antikörper gegen Lymphozyten (Antilymphozyten-Globuline) dienen zur Verhinderung sowie Behandlung von Abstoßungsreaktionen nach Organtransplantationen. Ebenfalls zur Unterdrückung von Immunreaktionen werden verschiedene gentechnologisch gewonnene monoklonale Antikörper, z. B. Basiliximab oder Infliximab, verwendet. Da Tumorzellen verstärkt bestimmte Oberflächenantigene ausbilden, können Antikörper auch gegen diese Strukturen eingesetzt werden. Alemtuzumab wird z. B. bei chronisch-lymphatischer Leukämie angewendet, Rituximab eignet sich zur Behandlung von Lymphomen, Trastuzumab zur Therapie bestimmter Brustkrebserkrankungen. Meyers Lexikonverlag Meyers Medien online Brockhaus Duden Harenberg Weingarten

15. Spezielle immunologische Testverfahren • Blutgruppenbestimmung • Rhesusfaktor • EliSpot • PIA • Immun-PCR

16. Blutgruppen • Beim A-B-Null-Blutgruppensystem findet sich auf der Membran der Erythrozyten entweder das Antigen A oder B bzw. es sind beide vorhanden ( AB ) oder es fehlen beide ( 0 ). Gleichzeitig sind bei den Blutgruppen A, B und 0 im Serum entsprechende Antikörper vorhanden, sogenannte Isoagglutinine (Anti-A bzw. Anti-B). Werden nun Antigene mit nicht passenden Blutpräparaten übertragen, kommt es im Körper des Empfängers zu einer Antigen-Antikörper-Reaktion: die roten Blutkörperchen verklumpen und können ihre Funktion des Sauerstofftransportes nicht mehr erfüllen. Besonders heftig ist die Unverträglichkeitsreaktion bei der Agglutination der übertragenen Blutkörperchen durch die Isoagglutinine des Empfängers. Diese sind nämlich in einer weitaus größeren Menge vorhanden als die übertragenen Erythrozyten.

17. Blutgruppen Tests • Zunächst werden die Blutproben zur Bestimmung der Blutgruppen vorbereitet. Jeweils ein Tropfen des zu prüfenden Blutes wird mit einem Testserum vermischt, das Antikörper enthält: Anti-A, Anti-B und ein Gemisch aus beidem. Je nach Blutgruppe kommt es dabei zur Verklumpung (Agglutination) der Probe oder nicht. Aus dem Ergebnis aller drei Poben lässt sich so auf die Blutgruppe des Spenders schließen. Mit der Blutgruppe wird außerdem der Rhesus-Faktor bestimmt. Beide Merkmale sind wichtig: Um lebensbedrohliche Zwischenfälle zu vermeiden, müssen nämlich bei einer Blutübertragung mit wenigen Ausnahmen (z.B. in Notfällen) die Blutgruppen von Spendern und Empfänger übereinstimmen.. http://www.blutspende-nstob.de/Wissenswertes_ueber_Blut/Laboruntersuchungen.htm

18. Rhesusfaktor • Neben dem AB0-System gibt es eine Reihe weiterer Blutgruppenmerkmale mit unter-schiedlicher Bedeutung für die Bluttrans-fusion. Von besonderer Bedeutung ist der Rhesusfaktor. Seinen Namen hat er von Rhesusaffen, bei denen er 1940 erstmalig entdeckt wurde. Der wichtigste Rhesusfaktor ist das Rhesusmerkmal D. Menschen, die dieses Rhesusmerkmal besitzen, sind Rhesus positiv (D+). Fehlt dieses Merkmal, so bezeichnet man sie als Rhesus negativ (D-). Im Gegensatz zu den AB0-Blutgruppen enthält das Blutplasma in der Regel keine Antikörper gegen eine Rhesuseigenschaft. Durch Übertragung von Rh-positivem Blut auf Rh-negative Empfänger kann es jedoch zur Bildung von Rhesus-Antikörpern und damit bei erneuter Transfusion von Rh-positivem Blut zur Transfusionsstörung kommen. Keine Folgen hat jedoch die Übertragung von Rh negativem Blut auf Rh positive Empfänger, so dass die Ärzte es im Notfall, wenn es schnell gehen muss, einsetzen können.

19. EliSpot (Enzym-linked immunospot Assay) • Der (Enzym-linked immuno-spot Assay) ist eine Methode zum Nachweis von spezifischer bzw. erreger-spezifischer zellulärer Aktivität. Genauer gesagt, weist man mit Hilfe des EliSpots T-Zellen nach, die aufgrund einer Immun-reaktion z.B. durch eine Infektion im Organismus aktiviert werden. Diese aktivierten Zellen lassen sich aufgrund ihrer Zytokinaus-schüttung messen, was im Assay als ein so genannter „Spot“ sichtbar wird.

20. ELISPOT-Test • Der ELISPOT (Enzyme Linked Immuno Spot Technique) misst die Freisetzung von Zytokinen oder Antikörpern einzelner Immunzellen unter Verwendung von Antigenen (immunogene, d.h. eine Immunantwort auslösende Eiweiß-strukturen) oder Antikörpern, die diese Zytokine bzw. an diese die Antikörper spezifisch binden. Ein Farbstoffsubstrat umsetzendes Enzym, welches an einen zweiten Antikörper gekoppelt ist, erlaubt es, die Zytokine als kleine rote oder blaue Punkte (Durchmesser 75-400 µm) am Boden von 96-Well-Mikrotiterplatten sichtbar zu machen. Durch automatische Auszählung mittels Software kann so bestimmt werden, welche spezielle Aktivität die Immunzellen besitzen, was für die Forschung und Diagnostik von Autoimmunerkrankungen, Transplan-tationsrisiken, Allergien und Infektions-krankheiten ebenso nützlich ist wie für die Impfstoffforschung

21. EliSpot Assay zum Monitoring von Transplantationspatienten • Der EliSpot kann in der Transplantationsdiagnostik als ein kombiniertes Modulsystem für folgende Fragestellungen dienen: • Beobachtung der zellulären Immunität eines Patienten vor und nach der Transplantation • Monitoring von latenten EBV, CMV oder BK-Infektionen • Ausschluss einer chronischen HCV-Infektion EBV: Eppstein Barr Virus HCV: Hepatitis C Virus

22. PIA: Partikel-Immunoassay • Phasen: • Konstruktion eines Nanopartikels, an das ein Fänger-Antikörper gebunden ist • Binden des Antigens • Binden des fluoreszensmarkierten Antikörpers • Partikelisolierung über Durchflusszytometrie • Quantifizierung der Signale auf den Partikeln

23. Durchflusszytometrie • Prinzip • Das Prinzip der Untersuchung beruht auf der Emission von optischen Signalen seitens der Zelle, wenn diese einen Laserstrahl passiert. Hierbei werden die in einer Lösung befindlichen Zellen durch eine Kapillare gesaugt und passieren im Sensormodul einzeln einen Laserstrahl. Die Zellen streuen einen Teil des Lichts, welches mittels Detektoren (Photomultiplier) nachgewiesen wird. Die Menge des gestreuten Lichts korreliert mit der Größe der Zelle und mit ihrer Komplexität. So streuen Granulozyten, die eine raue Oberfläche und in ihrem Inneren viele Vesikel haben, deutlich mehr Licht als die sehr glatten T-Zellen. Das Vorwärtsstreulicht (FSC = Forward Scatter) ist ein Maß für die Beugung des Lichts im flachen Winkel und hängt vom Volumen der Zelle ab. Das Seitwärtsstreulicht (SSC = Sidewards Scatter) ist ein Maß für die Brechung des Lichts im rechten Winkel, die von der Granularität der Zelle, der Größe und Struktur ihres Zellkerns und der Menge der Vesikel in einer Zelle beeinflusst wird. Mit diesen beiden Parametern lassen sich zum Beispiel die Zellen des Blutes bereits recht gut unterscheiden. • Fluoreszenzmessungen • Zugleich mit dem gestreuten Licht kann man im Durchflusszytometer Fluoreszenzfarben messen. Nur wenige Zellen emittieren per se fluoreszierendes Licht. Daher verwendet man Farbstoffe, die an bestimmte Bestandteile der Zellen binden. Setzt man z.B. die Farbstoffe DAPI und Propidiumiodid ein, welche in die DNA einer Zelle interkalieren, kann man anhand der Helligkeit der Zelle untersuchen, wieviel DNA sie enthält. Auch Antikörper, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, können verwendet werden. Die Antikörper sind meist gegen bestimmte Oberflächenproteine (z.B. Proteine der CD-Klassifizierung; CD = Cluster of differentiation) gerichtet. Nach Markierung kann dann auch die Sortierung nach diesen Merkmalen erfolgen. Durch Einsatz verschiedenfarbiger Laser kann die Anzahl der einsetzbaren Farbstoffe und damit die Informationsdichte erhöht werden. Bei Verwendung mehrerer Laser kann eine Vielzahl von Fluoreszenzfarben gleichzeitig gemessen werden.

24. PIA Auswerung

25. Immun-PCR Immuno-PCR zum extrem sensitiven Antigen-Nachweis durch PCR-Amplifikation einer an den Detektions-Antikörper gebundenen DNA. Der Schlüssel zum Verfahren liegt in der Kopplung zwischen Antikörper und DNA sowie in der Vermeidung unspezifischer Bindungen. Die Kopplung kann z.B. durch ein rekombinantes bispezifisches Protein, durch kovalente Verknüpfung oder mit Hilfe des Streptavidin / Avidin - Biotin - Systems erreicht werden.

26. Immun-PCR • The protocol is divided into three sections: • part I (preparation of capture antibody-coated microplates and antigen binding, Steps 1–11) and • part II (assembly of the signal-generating immunocomplex, Step 12) refers to sequential qIPCR (option A), the modular qIPCR (option B) or direct qIPCR (option C) • part III (readout by real-time PCR, Steps 13–26) are identical in all qIPCR strategies described

27. ….zu guter Letzt • Evaluierung • Prüfungen • Bakk Arbeiten