BRUNO LEONARDO DE FREITAS SOARES

1. BRUNO LEONARDO DE FREITAS SOARES EFEITOS DO ALPROSTADIL NA SÍNDROME DE ISQUEMIA E REPERFUSÃO EM TECIDO RENAL DE RATOS São Paulo 2005 Projeto de Tese apresentado à Universidade Federal de São Paulo/ Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Mestre em Ciências

2. 1. Introdução 1.1 - Contexto • Bywaters, 1941 Descrição de síndrome associada a extensas lesões musculares traumáticas • Haimovici, 1960 Síndrome metabólica pós-revascularização • Haimovici, 1973 Síndrome mionefropática ou de reperfusão • Burihan, 1982 O nível de obstrução e a massa muscular envolvida são importantes na síndrome Bywaters EGL, Beall D. Crush injuries with impairment of renal function. Br Med Journ 1960,;1:427-32. Haimovici H. Arterial embolism with acute massive ischemic myopathy and myoglobinuria. Surgery 1960; 47: 739-47. Haimovici H. Miopathic nephrotic metabolic syndrome associated with massive acute arterial occlusion. Arch Surg 1999 nov; 18(5): 439-44. Francisco JR, Burihan E. Tratamento das embolias aorto-iliacas. Revista de tema livre do 16 Congresso Brasileiro de Cirurgia 1982; p.79.

3. 1.1- Contexto • Myers, 1986  Injúria renal decorre da magnitude e da duração da isquemia • Joves, 1982  A isquemia leva ao edema intersticial com obstrução tubular e necrose tubular aguda • Ward, 1988  Pouco progresso no tratamento a despeito do conhecimento Myers BD, Mran SM. Hemodinamically mediated acute renal failure. N Eng J Med 1986;314:97. Joves DB. Ultrastructure of acute renal failure. Lab Invest 1982;46:254. Ward MH. Factors predictive of acute renal failure in rhabomyolysis. Arch Int Med 1988; 148: 1553-7.

4. 1.1- Contexto • Granger, 1988  Radicais livres de oxigênio e lesão celular • Vargas, 1995  Efeito atenuante da PGE1 no tecido isquêmico renal reperfundido em ratos • Kelly, 1996  Mecanismo direto e indireto de lesão celular: Molécula de adesão intercelular tipo 1 (ICAM1) Granger DN. Role of Xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol 1988;225:1269-75. Vargas AV. Krishnamuthi V, Masih R, Robinson AV, Schulak JA. Prostaglandin E1 attenuation of ischemic renal reperfusion injury in the rat. J AM Coll Surg 1995;180(6):713-7. Kelly KJ, Williams JR, Colvin RB, Bonventre JV. Antibody to intercellular adhesion molecule 1 deficient mice are protected against ischemic renal injury. J Clin Invest 1996;97:1056-63.

5. 1.1- Contexto • Alprostadil: análogo da prostaglandina (PGE1) • Vargas, 1995  Bloqueio de substâncias quimioatrativas • Linderman, 1998  Diminuição da adesividade leucocitária • Gupta, 1998  Diminuição da expressão das moléculas ICAM-1 • Linderman, 1998  Diminuição da resistência vascular periférica Vargas AV. Krishnamuthi V, Masih R, Robinson AV, Schulak JA. Prostaglandin E1 attenuation of ischemic renal reperfusion injury in the rat. J AM Coll Surg 1995;180(6):713-7. Lindermann S, Gierer C, Darius H. Prostacyclin inhibits adhesion of polymorphonuclear leukocytes to human vascular endothelial cells due to adhesion molecule independent regulatory mechanisms. Basic Res Cardiol 2003 Feb;98(1)8-15. Gupta PC, Matsushita M, Oda K, Nishikimi N, Sakurai T, Nemura Y. Attenuation of renal ischemia-reperfusion injury in rats by alloprurinol and prostaglandin E1. Eur Surg Res 1998;30(2):102-7.

6. 1.2- Hipótese O uso do alprostadil, por via intravenosa, atenua o efeito das lesões metabólicas e histológicas e imuno-histoquímicas na isquemia e reperfusão em tecido renal de ratos

7. 1.3- Objetivo Avaliar os efeitos da infusão intravenosa do alprostadil num modelo experimental de isquemia e reperfusão em tecido renal de ratos

8. 2. Métodos Projeto aprovado pelo comitê de ética da UNCISAL, protocolo 16-A, em13/10/2004. 2.1-Tipo de estudo - Ensaio clínico aleatório em animais de experimentação 2.2-Local 2.2.1-Laboratório do Departamento de Cirurgia Experimental e Técnica Operatória - FMSP-BA

9. 2. Métodos 2.3 –Amostra • Ratos machos • Linhagem OUT B Wistar • Idade - 90 a 120 dias • Peso - 250 a 350 g • 15 dias - observação e adaptação • Condições controladas 2.3.1 – Amostragem • Animais provenientes do biotério do Departamento de Cirurgia Experimental e Técnica Operatória da FMSP-BA

10. 2. Métodos 2.4 Procedimentos 2.4.1 - Randomização - Envelopes - Sorteio aleatório - Examinadores

11. 2. Métodos 2.4 Procedimentos 2.4.2 - Grupos experimentais • Grupo Sh (10 animais ) – Realização de microcirurgia sem isquemia ou reperfusão. Infusão de Solução salina (SF 0,9%) atráves da veia jugular externa (V.J.E) após 1h e 30 minutos de procedimento. • Grupo Ct ( 10 animais ) – Procedimento microcirúrgico normal, com isquemia e reperfusão. Infusão de SF 0,9% antes da reperfusão. • Grupo Al ( 10 animais ) – Procedimento idêntico ao Grupo II, exceto pela infusão de 20microgramas/kg Alprostadil, antes da reperfusão.

12. 2.4 Procedimentos 2.4.3 Modelo experimental • Pré operatório • Foram submetidos a jejum (6h) • Foram devidamente pesados • Submetidos a sorteio • Anestesia • Fenobarbital sódico (45mg/kg) via intraperitoneal • Sono profundo • Estímulos dolorosos irresponsivos • Doses complementares de anestésico

13. 2.4- Procedimentos 2.4.3- Modelo Experimental • Dissecção, isolamento e cateterização da veia jugular externa • Tricotomia ventral abdominal com lâmina de barbear • Incisão abdominal mediana • Abordagem transperitoneal da aorta, com isolamento do segmento abdominal até acima das artérias renais • Oclusão da aorta supra-renal por 30 minutos(Grupos Ct e Al) • Liberação do clampe e reperfusão 1 h (Grupos Ct e Al) • No Grupo Sh não há isquemia e reperfusão

14. 2.4- Procedimentos 2.4.3- Modelo Experimental • Infusão de SF 0,9% (Grupo Ct) e Alprostadil (Grupo Al), antes da reperfusão • Amostras de sangue • Nefrectomia esquerda e preparo das peças • Eutanásia – dose anestésica letal

15. 2.4 Procedimentos

16. 2.4 Procedimentos 2.4.3 Modelo experimental • Estudo histológico (microscopia ótica) • Hematoxilina eosina • Ácido Periódico de Schiff (PAS) • Azul patente (Azul de Alcion) • Estudo Imunohistoquímico (Laboratório de biologia molecular da Fiocruz-Salvador) • Amostras de Tecido Renal

17. 2.5.1- Variáveis primárias 2.5.1.1- Estudo imunohistoquímico • Dosagem de Molécula de adesão intercelular do tipo 1 (ICAM-1) • Análise qualitativa de desarranjo estrutural

18. 2.5.1- Variáveis primárias Tecido renal sem isquemia Tecido renal com isquemia e reperfusão

19. 2.4 Procedimentos Grau II Grau I

20. 2.4 Procedimentos Grau IV Grau III

21. 2.5.1- Variáveis primárias 2.5.1.2- Estudo histológico Jablonski, 1983 • Grau 0: Normal • Grau 1: Mitoses e necrose de células individualmente • Grau 2: Necrose de células adjacentes aos túbulos contorcidos proximais, porém sendo estes ainda viáveis • Grau 3: Necrose confinada ao terço distal do túbulo contorcido proximal. Desarranjo estrutural moderado • Grau 4: Necrose abrangendo todas as porções do túbulo contorcido proximal com desarranjo estrutural severo intersticial

22. 2.5.1.2 Estudo histológico 2.5.1 Variáveis primárias

23. 2.5.1.2 Estudo histológico 2.5.1 Variáveis primárias Grau II Grau I

24. 2.5.1 Variáveis primárias • 2.5.1.2 Estudo histológico Grau IV Grau III

25. 2.5.2 Variáveis secundárias 2.5.2.1- Avaliação bioquímica sérica • Desidrogenase lática Leucometria • Creatina-fosfoquinasePotássio • Lactato Hemogasimetria • Uréia • Sódio • Creatinina • Cálcio

26. 2.6- Modelo Estatístico 2.6.1- Cálculo do tamanho da amostra 2.6.2- Análise estatística • Análise de variância por postos de Kruskal Wallis • Teste de Mann-Whitney para duas amostras independentes • P = 0,05 ou 5% Nível de rejeição da hipótese de nulidade

27. 3. Resultados 3.3 Variáveis Primárias Gráfico 1. Distribuição dos graus de necrose entre os grupos

28. 3. Resultados 3.3 Variáveis Primárias Gráfico 2. Análise Imunohistoquímica entre os grupos

29. 3. Resultados3.3 Variáveis Primárias Gráfico 3. Comparativo da análise histológica entre os grupos

30. 3. Resultados 3.1 Caracterização da amostra □ Grupo Sh □ Grupo Ct □ Grupo Al Gráfico 4. Médias do pesos dos ratos dos três grupos de tratamento.

31. 3. Resultados 3.3 Variáveis secundárias Gráfico 5. Comparação dos níveis de eletrólitos dos três grupos de tratamento.

32. 3. Resultados 3.3 Variáveis secundárias ■ Grupo Al Gráfico 6. Comparação de LDH e CPK dos três grupos de tratamento.

33. 3. Resultados 3.3 Variáveis secundárias Controle Alprostadil SF0,9% Gráfico 7. Comparação da Gasometria (pO2 e pCO2) dos três grupos de tratamento.

34. 3. Resultados 3.3 Variáveis secundárias ■ Alprostadil Gráfico 8. Comparação de Lactato e Uréia dos três grupos de tratamento.

35. 4. Conclusões • O Alprostadil, na dose de 20 microgramas/kg, atenua as repercussões imunohistoquímicas e histológicas em tecido renal de ratos submetidos a um modelo experimental de isquemia e reperfusão com clampeamento aórtico supra-renal • Exceto pelos níveis de CPK, o Alprostadil na dose de 20 microgramas/kg, não foi capaz de modificar as alterações metabólicas pelos parâmetros utilizados neste estudo