BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE 2010-11 LEZIONE 15

1. CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE 2010-11 LEZIONE 15

2. FARMACI BIOTECNOLOGICI PROTEINE TERAPEUTICHE DI PRIMA E SECONDA GENERAZIONE ACIDI NUCLEICI per la regolazionedellaespressionedispecificigeni

3. VANTAGGI NELL’UTILIZZO DI FARMACI ANTI-ACIDI NUCLEICI BERSAGLIO MOLECOLARE PIU’ DEFINITO Numero di proteine intracellulari: 1000-100000 Numero di RNA: 100-10000 Numero di geni: 1-2 AZIONE MOLTO SPECIFICA Bersagli possono essere sequenze anche uniche nel genoma Utilizzando interazioni con altri nucleotidi si possono sfruttare i vantaggi della complementarità tra due catene secondo il modello di Watson e Crick

4. ESPRESSIONE GENICA IN EUCARIOTE: SEQUENZA DI EVENTI TRASCRIZIONE MODIFICAZ. TP TRADUZIONE 3’ RNA, trascritto primario Capping e poliadenilazione Splicing o maturazione Fuoriuscita dal nucleo riconoscimento da parte dei ribosomi • traduzione • Modificazioni post-traduzionali

5. La rilevanza dei processi di regolazione della espressione genica nel disegno di nuovi farmaci L’omeostasicellulare è mantenutada un efficientecontrollodellatrascrizionegenicachevieneassicuratoda un complessocircuitomolecolarecheutilizzafattoriditrascrizioneindividali, l’apparatobasaleditrascrizionee icomplessimultiproteicicoregolatoridellatrascrizione.

6. La cromatina ha un ruolofondamentalenellareglazionedellaespressionegenica e la capacitàdegliistonidilegareil DNA è regolatadaenzimiintranuclearichepossonoapportaremodificazioni post-traduzionalisoprattuttoairesiduidilisina e argininapostineldominio N-terminaledelleproteineistoniche Modificazionidegliistoni: acetilazione, fosforilazione, metilazione, ubiquitinazione

7. MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI DEGLI ISTONI Zhang Y , Reinberg D Genes Dev. 2001;15:2343-2360

8. Metilazionedegliistoni La metilazionedegliistoniaumenta lo statodiidrofobicità e la basicitàdelleporzioni N terminalidegliistoni: questo ne aumental’affinità per proteinespecifiche e fattoriditrascrizione. Le metilasinecessitanodicofattori: es. la s-adenosilmetionina Generalmente la metilazionedegliistonisiassocia a repressionedellaespressionegenica, tuttaviacisonoesempi in cui la metilazionesiassocia a attivazionedellaespressionegenica (metilazionelellalisina 4 dell’istone 3, ilcoattivatore CARM1 è unametiltransferasi)

9. PROCESSI DI ACETILAZIONE E DEACETILAZIONE SONO IMPORTANTI NELLA REGOLAZIONE DELLA ATTIVITA’ DELLA CROMATINA ESPRESSIONE GENICA E’ GENERALMENTE ASSOCIATA CON ACETILAZIONE

10. L’acetilazione dei residui di lisina al terminale NH degli istoni rimuove le cariche positive riducendo quindi l’affinità degli istoni per il DNA: per questo l’acetilazione degli istoni facilita i processi trascrizionali , al contrario, la deacetilazione reprime la trascrizione . Acetilazione e deacetilazione del residuo lisinico ACETIL TRANSFERASI ISTONICHE :histoneacetyltransferases(HATs) DEACETILASI ISTONICHE: histonedeacetylases(denotedbyHDs or HDACs); numerose deacetilasi sono associate a repressori della trascrizione;

11. Fosforilazionedegliistoni la funzione della fosforilazione degli istoni rimane da essere pienamente compresa: è stato riportato che la fosforilazione degli istoni puo’ facilitare l’attacco di HATs Enzimi quali le ERK possono fosforilare gli istoni legando signaling di recettori di membrana allo stato di fosforilazione degli istoni

12. Fattoridirimodellamentodellacromatina Due famigliedifattorisonocoinvoltenelrimodellamentodellacromatna: SWI/SFI e ISWI: in generequesteproteinedestabilizzanoillegametraistoni e DNA aiutando lo “scivolamento” deinucleosomi e la trascrizione del DNA : questeproteinefungonoquindidaenhancersdellatrascrizione. Esistonoinoltreproteine non istonichechefacilitanoillegamedelle HAT AltrifattoridirimodellamentodellacromatinaagisconoutilizzandoATP e possonoriposizionareinucleosomisullacromatina (ACF e NAP-1)

13. Meccanismi di metilazione del DNA e eredità epigenetica

14. Meccanismi di metilazione del DNA ed eredità epigenetica Circa il 2-7% delle citosine nel DNA animale subisce metilazione ad opera di specifici enzimi che agiscono su sequenze palindromi: 5’ mCpG 3’ 3’ GpCm 5’

15. CpG islandsare genomic regions that contain a high frequency of CG nucleotides. In mammalian genomes, CpG islands are typically 300-3,000 base pairs in length. They are in and near approximately 40% of promoters of mammalian genes (about 70% in human promoters). The "p" in CpG notation refers to the phosphodiester bond between the cytosine and the guanine. The usual formal definition of a CpG island is a region with at least 200 bp and with a GC percentage that is greater than 50% and with an observed/expected CpG ratio that is greater than 60%. Another recent study revised the rules of CpG island prediction in order to exclude other GC-rich genomic sequences such as Alu repeats. Based on an extensive search on the complete sequences of human chromosomes 21 and 22, DNA regions >500 bp with a GC content >55% and observed CpG/expected CpG of 0.65 were more likely to be the true CpG islands associated with the 5' regions of genes.

16. ESPRESSIONE GENICA E’ GENERALMENTE ASSOCIATA CON DEMETILAZIONE I GENI “HOUSEKEEPING” SONO ESPRESSI IN MODO COSTITUTIVO E CONTENGONO NEL LORO PROMOTORE MOLTE “ISOLE” CpG NON METILATE

17. A Unifying Model for the Selective Regulation of Inducible Transcription by CpGIslands and Nucleosome Remodeling Vladimir R. Ramirez-Carrozzi,1,2,5 Daniel Braas,1,2,5 Dev M. Bhatt,1,2,5 Christine S. Cheng,4 Christine Hong,1,2 Kevin R. Doty,1,2 Joshua C. Black,2,3 Alexander Hoffmann,4 Michael Carey,2,3 and Stephen T. Smale1,2,* Cell 138: 114, 2009 CpG island promoter: 70% deipromotorihannonumerosesequenzericche in CpG : basso livellodimetilazionedelleCpG island chelirendeindipendentida SWI/SNF remodeling complexes Non CpG island promoter: 30% deipromotorichesonoaltamenteregolatitrascriionalmente

18. MECP2 methylCpGbindingprotein 2 (Rettsyndrome)

19. SindromediRett MeCP2 gene

20. methyl DNA bindingprotein 2 (MeCP2) (a) The mechanism(s) by which the native MeCP2 protein operates in the cell are not well understood. Historically, MeCP2 has been characterized as a proximal gene silencer with 2 functional domains: a methyl DNA binding domain and a transcription repression domain. However, several lines of new data indicate that MeCP2 structure and function relationships are more complex: an analysis of cell-based experiments suggesting MeCP2 is a regulator, rather than a strict silencer, of transcription. The new data establish MeCP2 as a multifunctional nuclear protein, with potentially important roles in chromatin architecture, regulation of RNA splicing, and active transcription..

21. methyl DNA bindingprotein 2 (MeCP2) (b) One complex shown to associate with MeCP2 is the Sin3A corepressor complex. This complex contains histonedeacetylase (HDAC) 1 and HDAC2 and was originally shown to mediate repression by the DNA-binding heterodimer, Mad-Max . MeCP2 also interacts with two other corepressors, the proto-oncoprotein of the Sloan-Kettering virus named after the Sloan-Kettering Institute (c-Ski) and the nuclear receptor corepressor (N-CoR). c-Ski and N-CoR are components of histonedeacetylase complexes that can but do not always function together It is interesting that repression by MeCP2 is not completely alleviated by the histone-deacetylase inhibitor, trichostatin A (TSA), suggesting that MeCP2 may also repress transcription in an HDAC-independent manner

22. Modeling Rett Syndrome with Stem Cells Cell 143: 499, 2010

23. METILAZIONE DEL DNA E CANCRO The alterations of DNA methylation level and patterns are a common feature of human cancer cells. A global DNA hypomethylation has been observed in many cancers, without obvious sequence specificity Recently, an extensive study of about 1200 CpG islands has indicated that hypermethylatedCpG islands are not randomly distributed and the patterns of the hypermethylation might be specific of subclasses of cancers. The methylation status of tumor suppressor genes has been extensively investigated and such alterations have been reported in many human tumors (Robertson and Jones, 2000).

24. METILAZIONE DEL DNA E CANCRO Several reports link genome hypomethylation to genome instability. In particular, it was shown recently that strongly reduced DNMT activity in a transgenic mouse model caused demethylation of centromeric satellite and other repeat sequences, which resulted in a variety of chromosome defects and concomitant tumorigenesis

25. FARMACI E METILAZIONE Peter Jones nel 1970 descrisseildifferenziamentodi cellule embrioniche in cellule muscolaridopoesposizione a unamolecolacapacediaumentare lo statodimetilazione del DNA (5-Azacytidine) . Nel 2004 la 5-azacytidine ( Vidaza) è statoapprovato per iltrattamentodellasindromemielodisplastica Nel 2006 è statoapprovataun’altramolecola la decitabina (Dacogen) : questemolecolesonosubstrati dell DNA methyltransferasi. Altrifarmaciepigenetici in studio sonogliinibitoridelleacetiltransferasi (HDAC inhibitors) il primo diquesti, SAHA (zolinza) è statoapprovatonel 2006 per illinfoma a cellule T cutaneo.

27. O H FARMACI E ACETILAZIONE N N OH O H VORINOSTAT (Zolinza) è il primo inibitore delle acetilasi istoniche approvato per il trattamento di neoplasie Nel 2006 il VORINOSTAT è stato approvato per il trattamento del linfoma a cellule T cutaneo Esistono studi preclinici che indicano una attività antinfiammatoria del vorinostat Nel 2007 ricerche presso la MayoClinics hanno dimostrato che il Vorinostat è efficace nel glioblastoma ricorrente N-hydroxy-N'-phenyl-octanediamide

28. HDAC inhibitors can activate both the death-receptor and intrinsic apoptotic pathways

29. REGOLAZIONE DELLA ESPRESSIONE GENICA IN EUCARIOTE A LIVELLO TRASCRIZIONALE

30. TBP + 12 TAFs (TBP ass. factors) TFIID recognizes TATA (Inr) commitment TFIIA; TFIIB; TFIIF Pol II entry TFIIE; TFIIH Promoter clearence TFIIF pol II binding TFII H helicase and kinase Bob Roeder Lasker Award 2003

31. Promotoriprossimali e promotoridistali

33. ESPRESSIONE GENICA IN EUCARIOTE: SEQUENZA DI EVENTI TRASCRIZIONE MODIFICAZ. TP TRADUZIONE 3’ RNA, trascritto primario Capping e poliadenilazione Splicing o maturazione Fuoriuscita dal nucleo riconoscimento da parte dei ribosomi • traduzione • Modificazioni post-traduzionali

34. Biogenesidi RNA messaggero e regolazionegenica post-trascrizionale Cell 136:777, 2009

35. INTRONI DI RNA NUCLEARE BERSAGLIO DELL’APPARATO DISPLICING

36. Ruolo snRNP e proteine associate nello splicing 1 5’ 3’ Commitment complex (E complex) U1 lega il sito di taglio in 5’ e U2AF lega il sito polipirimidinico 5’ 3’ 5’ 3’ Complex A U2 lega il sito “branch” Complex B si associano U5, U6, U4

37. Ruolo snRNP e proteine associate nello splicing 2. Riposizionamento, U1 si dissocia, U5 si associa all’introne; U 6 lega il sito di taglio in 5’ Complex C U4 si dissocia, U6 e U2 catalizzano la transesterificazione U5 l’esone al sito di taglio in 3’ Avviene il taglio in 5’ e si forma il lariate Avviene il taglio in 3’ e la ligazione Tra gli esoni

38. LE SEQUENZE DI SPLICING SONO CONSERVATE NEI VERTEBRATI 5’ splice site: 5’-GU-3’ Tratto polipirimidinico 3’ splice site 5’-AG-3’

39. Esistono introni AU-AC sono simili a introni GU-AG ma richiedono Un apparato di splicing differente

40. L’eliminazionedisequenzedi RNA che non abbianosubitoilprocessamento è assicuratadallapresenzadi “nonsense-mediated mRNA decay” un meccanismodi turnover di RNA chedegradasequenze in cui siapresente un segnaledi stop Questosuggerisce la co-evoluzionedeimeccanismidi splicing e ditraduzione del segnale

41. Mutazionichealteranoilcodicedi slicing causanopatologiespecifiche

42. Micro RNA e regolazionedellaespressionegenica

43. Cell 136: 777, 2009