Adriana Maggi DOCENTE DI BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE

1. Adriana Maggi DOCENTE DI BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA 2011/2012 Lezione 3

2. La GENOMATICA e la ricerca di nuovi bersagli farmacologci

3. GENOMATICA: • studio del genoma* degli esseri viventi attraverso la mappatura o sequenziamento dei geni e lo studio della loro funzione • * Per genoma si intende l’intero contenuto in DNA di una cellula, geni e sequenze intrageniche incluse

4. genoma umano Il genoma nucleare umano è costituito da 3.000.000.000 di paia di basi diviso in 24 sequenze lineari : i cromosomi di cui 22 sono autosomi e 2 sono i cromosomi sessuali Il DNA mitocondriale è circolare e ha le dimensioni di 16569 pb

5. Che significato ha localizzare fisicamente i geni nei diversi cromosomi? • Come si costruiscono le mappe geniche? • Storicamente attraverso la costruzione di mappe fisiche (identificare e ordinare marcatori lungo il cromosoma) • Attualmente con il sequenziamento

6. Costruzione di mappe fisiche • FISH (Fluorescent in situ hybridization) mapping • studigeneticidi ‘linkage’ • restriction mapping dibanchedi DNA • use of sequence tagget site (STS)

7. FISH (Fluorescent in situ hybridization) mapping

9. FISHper studiare • Omologiedisequenza • Moltiplicazionedigeni • Evoluzione del DNA • FISHper localizzare • Delezioni • Traslocazioni • Inserzioni

10. restriction mapping

11. RESTRICTION MAPPING Frammentazione del DNA genomico con enzimidirestrizione Separazionedeiframmenti per elettroforesisuagarosio Immobilizzazione DNA per trasferimentosumembrana Ibridazione con sondaopportunamentemarcata Identificazionedi RLFP

12. 4E 5E 6E 3B 7B 5B 3 5 1 5 1 Gel Data Uncut: 15 kb EcoR1: 4, 5, 6 kb BamH1: 3, 5, 7 kb EcoR1 & BamH1: 1, 3, 5 kb RESTRICTION MAPPING B E E B 3B1E5E1B5 = 5B1E5E1B3

13. RESTRICTION MAPPING

14. restriction mapping sequence tagget site

15. A sequence-tagged site (or STS) is a short (200 to 500 base pair) DNA sequence that has a single occurrence in the genome and whose location and base sequence are known. STSs can be easily detected by the polymerase chain reaction (PCR) using specific primers. For this reason they are useful for constructing genetic and physical maps from sequence data reported from many different laboratories. They serve as landmarks on the developing physical map of a genome. When STS loci contain genetic polymorphisms (e.g. simple sequence length polymorphisms, SSLPs, single nucleotide polymorphisms), they become valuable genetic markers, i.e. loci which can be used to distinguish individuals. They are used in shotgun sequencing, specifically to aid sequence assembly.

16. studigeneticidi ‘linkage’

17. IL MAPPAGGIO GENETICO Analisi di linkage

18. SU COSA SI BASA IL LINKAGE? Due geni che mappano sullo stesso cromosoma si dicono SINTENICI Due geni sintenici segregherebbero sempre assieme se non esistesse il crossing-over nella prima divisione meiotica l’evento di crossing-over da luogo alla formazione di gameti RICOMBINANTI SINTENICI

19. LA CONCATENAZIONE o LINKAGE Consente di mappare un gene sulla base dello studio della sua vicinanza ad un altro locus sullo stesso cromosoma.

22. LA MEIOSI ED I GAMETI RICOMBINANTI • Il crossing-over avviene durante la meiosi • L’evento di crossing-over porta alla formazione di gameti ricombinanti • Se due loci non sono associati avremo il 50% di gameti non ricombinanti ed il 50% di gameti ricombinanti per questi due loci

23. IN GENERALE • Il crossing-over separerà raramente loci che si trovano molto vicini sullo stesso cromosoma, in quanto un solo evento di crossing-over localizzato esattamente nel piccolo spazio tra i due loci creera’ dei ricombinanti • Più due loci sono distanti, più è probabile che un evento di crossing-over li separi • Si definisce un valore detto frazione di ricombinazione, misura della distanza di due loci

24. LA DISTANZA GENETICA Il centimorgan(cM) e’ l’unita’ di misura della distanza genetica di due loci DUE LOCI CHE PRESENTANO 1% DI RICOMBINAZIONE SONO DEFINITI DISTANTI 1 cM

25. Conoscendo la frazione di ricombinazione • Sapendo che due loci distanti 1 cM avranno una frazione di ricombinazione uguale a 0,01 • Possiamo ricavare la distanza genetica fra due loci • Ricordando che LA DISTANZA GENETICA NON E’ UGUALE ALLA DISTANZA FISICA

26. Doppio crossing over

27. Dopo una certa distanza fisica la frazione di ricombinazione non rispecchia più la distanza genetica per l’esistenza di doppi crossing-over • Loci che distano su una mappa 40 cM hanno una ricombinazione molto inferiore al 40%, in quanto la frazione di ricombinazione non supera mai lo 0,5 • La frazione di ricombinazione sara’ uguale a 0,5 non solo per loci non sintenici, ma anche per loci sintenici molto distanti fra loro

28. LE FUNZIONI DI MAPPA • La funzione di mappa definisce la relazione tra funzione di ricombinazione e distanza genetica • Esistono diverse funzioni di mappa, che tengono conto di diverse variabili • La più semplice funzione di mappa è la funzione di Haldane • ω= -1/2 ln (1-2θ) • θ= 1/2[1-exp(-2ω)] • dove ω e’la distanza di mappa e • θ è la frazione di ricombinazione

29. IL MAPPAGGIO GENETICO NELL’UOMO • Associare il gene ad un cromosoma e conoscere la sua posizione • Solitamente vengono studiati geni che, se mutati, sono responsabili di un fenotipo patologico • L’analisi di concatenazione nell’uomo si basa sullo studio degli alberi genealogici e sulla ricerca delle meiosi informative • Una meiosi è informativa quando si può identificare se il gamete è o meno ricombinante

30. IL MAPPAGGIO GENETICO NELL’UOMO • Per mappare i geni nell’uomo vengono usati dei marcatori • il MARCATORE è un carattere mendeliano sufficientemente polimorfico da offrire una ragionevole probabilità che una persona scelta a caso sia eterozigote. • Per mappare il gene è necessario conoscere la posizione del marcatore. Vengono costruite per questo delle mappe genetiche dei marcatori usando un mappaggio marcatore-marcatore

31. QUALI CARATTERI SONO USATI COME MARCATORE? • Qualsiasi carattere mendeliano e polimorfico può essere usato come marcatore • E’ meglio che il carattere possa essere individuato facilmente e a basso costo • Per rendere più facile il mappaggio è necessario che i marcatori siano tanti e quanto piu’ possibile vicini fra loro (progetto genoma)

32. BREVE STORIA DEI MARCATORI • 1910-1960 Gruppi Sanguigni e Varianti della mobilita’ elettroforetica delle proteine del siero • 1970-Tipi Tissutali HLA • 1975-RFLP del DNA • 1985-Minisatelliti • Oggi Microsatelliti

33. Si definiscono microsatelliti (o short tandem repeats o STR) sequenze ripetute di DNA non codificante costituiti da unità di ripetizione molto corte (1-5 bp) disposte secondo una ripetizione in tandem, utilizzabili come marcatori molecolari di loci. La loro presenza nel genoma umano non influisce per più del 3%, ma si pensa che comunque essi svolgano una funzione essenziale per la struttura dei cromosomi. II microsatellitisonoereditati in modomendeliano Esempi di microsatelliti: AAAAAAAAAAA o (A)11 GTGTGTGTGTGT o (GT)6 CTGCTGCTGCTG  o (CTG)4 ACTCACTCACTCACTC o (ACTC)4

34. MAPPATURA DI UN GENE-MALATTIA • Ricostruzione dell’albero genealogico delle famiglie da analizzare • Tipizzazione delle famiglie con marcatori informativi • Analisi statistica dell’associazione tra i marcatori e la comparsa della malattia

35. I PROBLEMI… E LA SOLUZIONE • Le famiglie da analizzare solitamente contano pochi membri, o sono disponibili i campioni biologici di un basso numero di individui • In famiglie poco numerose vi e’ un basso numero di ricombinanti • I risultati cosi’ ottenuti hanno una bassa significatività statistica • La soluzione è analizzare più famiglie assieme. Per questo è stato introdotto il LOD SCORE • Il LOD SCORE e’ definito come il logaritmo delle probabilità che i loci siano associati (con frazione di ricombinazione θ) piuttosto che non associati (frazione di ricombinazione 0,5)

36. IL LOD SCORE E’ LA MISURA STATISTICA DEL LINKAGE • Il LOD SCORE (Z) e’ una funzione della frazione di ricombinazione • Vengono calcolati i valori di LOD SCORE per una gamma di valori di θe ne viene stimato il valore massimo (Ž) • La probabilità complessiva di linkage in un gruppo di famiglie è il prodotto delle probabilità in ciascuna famiglia, per cui i lod score di famiglie diverse, che sono logaritmi, possono essere sommati

37. PRINCIPALI VALORI DI LOD SCORE • Tutti i lod score sono uguali a 0 per θ=0,5 poiché si sta misurando il rapporto di due probabilità identiche • I due loci sono in linkage con una probabilità di errore del 5%quando Z e’maggiore o uguale a 3, cioe’quando la probabilità di linkage è mille volte laprobabilità che i due loci non siano concatenati • I due loci non sono in linkages Z e’minore di -2 • Valori tra i due estremi non permettono conclusioni

38. SOFTWARE PER IL MAPPAGGIO GENETICO • Per il calcolo dei lod score vengono usati i programmi LIPED e MLINK • Il programma EXCLUDE trasforma i dati negativi di linkage in un diagramma delle possibili localizzazioni residue

40. IL MAPPAGGIO A PIU’ PUNTI • Serve a mappare un locus patologico rispetto ad una batteria di marcatori • Aiuta a superare i problemi causati dalla limitata informatività dei marcatori • Particolarmente utile, soprattutto per quanto riguarda la costruzione di mappe dei marcatori, per stabilire l’ordine lungo un cromosoma di un gruppo di loci associati

41. IL MAPPAGGIO A PIU’ PUNTI DI UN GENE-MALATTIA • Lo scopo è localizzare il gene in uno degli intervalli della mappa dei marcatori • Viene usato il programma LINKMAP che ricava le posizioni del locus-malattia rispetto la griglia di marcatori, calcolando la probabilità complessiva dei dati di linkage per ciascuna delle posizioni possibili

42. IL RISULTATO Il risultato che si ottiene e’ una curva diprobabilita’rispetto alle localizzazioni di mappa Il picco piu’ alto indica la posizione piu’ probabile del locus malattia Le regioni in cui la curva si trova al di sotto del valore di -2 vanno escluse dall’analisi Oggi, il mappaggio marcatore-malattia a piu’punti non viene usato, a eccezione che per il mappaggio di esclusione

43. COSTRUZIONE DELLE MAPPE MARCATORE-MARCATORE • Uso di famiglie raccolte specificamente a questo scopo dal CEPH (Centrepourl’EtudedesPolymorphismesHumaines) • Linee cellulari immortalizzate di tutti i membri delle famiglie disponibili a richiesta per la mappatura di un nuovo marcatore • Risultati delle mappe disponibili in banca dati ad uso di tutti

44. ORDINE DEI MARCATORI • E LORO DISTANZA NELLE MAPPE • Per la costruzione delle mappe dei marcatori e’ indispensabile il mappaggio a piu’ punti • Per determinare l’ordine dei marcatori vengono usati metodi di mappaggio fisico, oltre che i calcoli di lod score • Le distanze genetiche marcatore-marcatore nelle mappe sono approssimative • Un obbiettivo del Progetto Genoma e’ la costruzione di mappe genetiche di marcatori che distano fra loro mediamente 1 cM

45. CENNI PER L’ANALISI DI LINKAGE SENZA MODELLI • Usata per lo studio di patologie non perfettamente mendeliane e caratteri multifattoriali come la schizofrenia, il diabete mellito, l’ipertensione… • I metodi usati trascurano l’analisi delle persone non affette • Ci si basa sulla ricerca dei segmenti cromosomici comuni agli individui affetti

46. CON CHI VIENE USATO IL METODO DEI SEGMENTI COMUNI ❚Studio di famiglie nucleari (tipo analisi di coppie di fratelli) ❚Studio di ampie famiglie note ❚Studio di popolazioni

47. POPOLAZIONI STUDIATE ❚POPOLAZIONI GENETICAMENTE ISOLATE ❚POPOLAZIONI GIOVANI: poche generazioni dal momento della fondazione, pochicrossing-overs, pochericombinazioni ❚POPOLAZIONI OMOGENEE: poche famiglie fondatrici

48. ESEMPI DI POPOLAZIONI STUDIATE ❚FINLANDESI: geneticamente e linguisticamente sono molto diversi dai loro vicini nordici e slavi; la popolazione e’ giovane in quanto fondata circa 2000 anni fa da poche famiglie fondatrici ❚ITALIA: studi condotti sulla popolazione SARDA, molto isolata geneticamente

49. STUDI DI ASSOCIAZIONE NELLE POPOLAZIONI ❚Le persone affette dalla malattia ignorano di essere imparentate ❚Molte generazioni e molte meiosi separano gli affetti dal loro antenato comune con una conseguente riduzione della regione identica per discendenza ❚All’interno della regione ci sara’, a livello di popolazione, un’associazione tra la malattia ed un particolare allele o aplotipo

50. http://www2.units.it/crovella/gene09.pdf ASSOCIAZIONE ALLELICA ❚Possibililta’di portare l’analisi di linkage a risoluzioni irraggiungibili con gli studi sulle famiglie anche per condizioni mendeliane ❚Relazioneallelemarcatore/allelemalattia ❚Marcatori con elevato potere di risoluzione (1 cM), con frequenze simili a quelledell’allelepatologico