Adriana Maggi DOCENTE DI BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE

1. Adriana Maggi DOCENTE DI BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA 2011/2012 Lezioni 21-22 Vaccini

2. SISTEMA IMMUNITARIO 1. immunità aspecifica o innata 2. immunità specifica o adattativa

3. IMMUNITA’ INNATA NON SPECIFICA • Difesefisiche • pelle • muco • mucose • Difesechimiche/umorali • Enzimi (egsecrezioniesocrinequali saliva, lacrimeecc.) • Mediatoriinfiammazione • Complemento • Difesecellulari • Fagociti( macrofagi, neutrofili e cellule dendritiche) mastcell, eosinofili, basofili e cellule natural killer

4. IMMUNITA’ INNATA NON SPECIFICA Caratteristichefondamentali capacità di rispondere ad un vasto numero di agenti patogeni grazie al riconoscimento di un limitato numero di profili molecolari non-self estremamente diffusi in natura (come LPS, glicani ricchi in mannosio, RNA a doppia elica, ecc.). La rapidità di risposta dovuta a meccanismi di riconoscimento presenti uniformemente su tutti i componenti dell’immunità aspecifica e sono completamente determinati a livello genetico senza alcun bisogno di processi maturativi di tipo epigenetico (cfr. immunità specifica).

5. IMMUNITA’ INNATA NON SPECIFICA- Limiti • efficacia non sempre ottimale • l’incapacità di adattarsi alle contromisure sviluppate dai microrganismi patogeni • una scarsa capacità di discriminazionetraself e non-self, che determina lo sviluppo di danni tessutali spesso sproporzionati rispetto all’entità dello stimolo immunogeno (infezione).

6. IMMUNITA’ INNATA NON SPECIFICA- Limiti • efficacia non sempre ottimale • incapacità di adattarsi alle contromisure sviluppate dai microrganismi patogeni • scarsa capacità di discriminazionetraself e non-self, che determina lo sviluppo di danni tessutali spesso sproporzionati rispetto all’entità dello stimolo immunogeno (infezione). Microscopiaelettronicadi un neutrofilocheingloba un batteriodiantrace

7. IMMUNITA’ ACQUISITA • Immunità umorale: generazione di anticorpi efficace quando il patogeno è nel tessuto ma non si è stabilito nelle singole cellule • Immunità cellulo mediata: cellule citotossiche efficace per i virus ed altri patogeni localizzati a livello intracellulare l’immunità specifica ha la capacità di adattarsi variabilità di agenti ambientali riconosciuti come un pericolo per l’organismo. Si calcola che tutte le possibili combinazioni molecolari presenti in natura e in grado di interagire con l’organismo si aggiri intorno a 1010 apprendimento – memoria - adattabilità

8. IMMUNITA’ ACQUISITA Immunità umorale: anticorpi che sono prodotti dalle plasmacellule derivate dai linfociti B. Il linfocita rileva un agente esterno grazie al suo recettore specifico e inizia la produzione di cellule clone che in parte saranno destinate alla memoria immunologica e in parte andranno a formare le plasmacellule. le plasmacellule poi produrranno gli anticorpi che si legheranno al corpo esterno bloccando i suoi siti attivi facilitando la fagocitosi da parte dei macrofagi. Immunità specifica cellulare: è svolta dai linfociti T citotossici che distruggono un virus che ha già infettato una cellula. La cellula T citotossica si lega alla cellula bersaglio, rilasciando perforina che forma canali sulla membrana plasmatica della cellula bersaglio

9. La cellula B riconosce e internalizzaxenocomposti e agiscequale “antigen presenting cell” presentandogliantigenialle cellule T CD4+ (T helper) che, riconosciutol’antigenecausanoildifferenziamentodelle cellule B (nellamilza e linfonodi) in cellule dimemoria o plasmoblasti I plasmoblastihanno la capacitàdiprodurreanticorpi (con menoefficienzadelleplasmacellule, sidividono e sonoancora in gradodiagirequali antigen presenting cells e una vita dialcunigiorni prima didifferenziarsi in cellulaplasmatica ad opera dispecificifattoriditrascrizione Le cellule plasmatiche non hannoipermutazionesomatica, non sono in gradodiinternalizzare e presentarel’antigene, hannounaemivitachepuo’ ancheesseredimesidurante I qualiproduconoanticorpimonospecifici a unavelocitadimigliaia/sec.

12. IMMUNIZZAZIONE • immunità congenita • immunità naturale passiva: (es. allattamento) • immunità naturale attiva

14. IMMUNIZZAZIONE • immunità congenita • immunità naturale attiva • immunità naturale passiva: (es. allattamento) • immunità artificiale attiva: vaccinazione • immunità artificiale passiva: sieroterapia

15. IMMUNIZZAZIONE ATTIVA- risposta umorale In seguito all’immunizzazione si attivano le cellule B che esprimono sulla superficie anticorpi specifici nel riconoscere gli epitopi del vaccino. Al momento del contatto con il vaccino, in collaborazione con le cellule T helper, la cellula B si attiva e si ha una massiccia proliferazione clonale. Si originano così le plasmacellule che secernono grandi quantitativi di anticorpi solubili specifici

16. IMMUNIZZAZIONE ATTIVA- memoria • Alcune cellule B attivate non diventano plasmacellule ma cellule della memoria • Persistono per anni • Il contatto con un antigene identico induce una rapida differenziazione a plasmacellule • Esistono anche cellule T della memoria Le cellule della memoria si riattivano in presenza di uno stesso patogeno e danno luogo ad una reazione immunitaria più veloce ed efficace della prima.

18. RISPOSTA SECONDARIA

20. TucididenellasuadescrizionedellapestediAtene (430 ac) nota isopravissutiallapestepotevano curare I malatisenzacontrarre la malattia per unasecondavolta Tucidide –mosaicodaJerash, MuseoAltes, Berlino

21. VACCINI: le prime osservazioni • Osservo’ che i mungitori quotidianamente a contatto col virus vaccinico (cowpox) raramente venivano infettati • “If you want to marry a woman who will never be scarred by pox, marry a milkmaid” Edward Jenner (1749 - 1823)

22. LE PRIME EVIDENZE • Nel 1796 James Phipps (un bambino di 8 anni) fu vaccinato con materialeprovenientedallalesioneprovocatadalvaiolobovinosullamanodi Sarah Neimes • 8 settimanedopo lo stesso bambino fu inoculato con il virus smallpox agentepatogeno del vaiolo • Il ragazzo non sviluppo’ ilvaiolo Hand of Sarah Neimes. Cowpox Pustule. From Jenner’s Inquiry 1798

23. PERCHE’?

24. LE PRIME VACCINAZIONI

25. VACCINAZIONI SUCCESSIVE 1840Disponibile per tutti 1841 Non obbligatoria 1853 Diventa obbligatoria 1871 Istituzione di uffici e personale addetto alla vaccinazione Multe ai genitori che non vaccinano i figli 1948 E’ ritirata l’obbligatorieta’ della vaccinazione

26. CRONOLOGIA DEI VACCINI 1790 Edward Jenner usò il virus vaccinico per proteggere dallo smallpox 1880 Luis Pasteur sviluppò il primo vaccino efficace per la rabbia 1890 Emil von Behring e KitasatoShibasaburo svilupparono i vaccini per il tetano e la difterite 1900 Furono messi a punto i primi vaccini per il tifo ed il colera 1910 Il vaccino per il tetano diventò disponibile 1920 Si iniziò ad usare il vaccino per la tubercolosi 1940 Si svilupparono i vaccini per l’influenza e la pertosse 1950 Vaccini per la poliomelite (orale Sabin e Salk iniettabile) 1970 Vaccino per il meningococco 1980 I primi vaccini prodotti con la tecnologia del DNA ricombinante 1990 Sviluppo di vaccini a subunità e vaccini contro malattie autoimmuni e cancro. Produzione di vaccini in vettori virali ricombinanti

27. Nobel Prize in 1908 Elie Metchnikoff PaulEhrlich

28. INCIDENZA DI ALCUNE PATOLOGIE PRE E POST-VACCINAZIONE

29. GLI ESITI DELLE VACCINAZIONI DI MASSA PER IL VAIOLO • Ultimo caso registrato a livello mondiale di “wild” smallpox • Somalia Ottobre 1977 • Ali Maalin (23 anni)

30. VACCINO COS’E’? E’ una sospensione di organismi o una frazione di organismo, usata per indurre una risposta immunitaria COME AGISCE? Simula un’infezione in maniera tale da attivare lo specifico meccanismo naturale di difesa dell’ospite contro il patogeno, così l’ospite rimane immune dalla malattia che normalmente segue all’infezione naturale

31. IMMUNIZZAZIONE PASSIVA COS’ E’? E’ la somministrazione di anticorpi specifici per assicurare all’ospite una protezione immediata ma di breve durata. Gli anticorpi sono isolati dal siero di pazienti convalescenti o da donatori che hanno livelli particolarmente alti di specifici anticorpi ESEMPI: -Tetano - Epatite B - Rabbia - Varicella Zoster - Siero contro il veleno di vipere e serpenti

32. I VACCINI: CARATTERISTICHE INNOCUO il vaccino non deve provocare malattia o morte PROTETTIVO il vaccino deve proteggere contro la malattia che deriva dall’esposizione dell’agente patogeno vivo CONFERISCE PROTEZIONE PROLUNGATA la protezione contro l’esposizione deve durare per diversi anni INDUCE ANTICORPI NEUTRALIZZANTI alcuni patogeni infettano cellule che non possono essere sostituite (es neuroni). Per prevenire l’infezione di simili cellule sono necessari anticorpii neutralizzanti CONSIDERAZIONI PRATICHE Basso costo per dose, stabilità biologica, facilità di somministrazione, pochi effetti collaterali

33. I VACCINI: CLASSIFICAZIONE 1- VACCINI CONVENZIONALI VIVI ATTENUATI UCCISI 2- MODERNI PERFEZIONATI CON LE TECNICHE DI INGEGNERIA GENETICA

34. I VACCINI VIVI ATTENUATI a- Mediante selezione di ceppi mutanti a virulenza o tossicità ridotte es: antipolio orale, polivalente contro parotite, rosolia, morbillo b- Mediante mutagenesi chimica es:Salmonella Typhi mutato con nitrosoguanidina VANTAGGI: Sono sufficienti dosi minime perché proliferano nell’ospite SVANTAGGI: - Per i vaccini virali il loro ac. nucleico può essere incorporato nel genoma dell’ospite - Possono ritornare alla forma virulenta

35. I VACCINI VIVI ATTENUATI-metodologie

36. VACCINI UCCISI: CLASSIFICAZIONE VACCINI UCCISI III gen. II gen. I gen. Purificazione del microrganismo patogeno o del componente protettivo Combinazione di componenti protettivi o aggiunta delle proprietà immunizzanti ad esso (es: polisaccaridi coniugati a prot vettrici) Sospensione inattivata del microrganismo patogeno. Purificazione poco o nulla

37. VACCINI UCCISI: organismi interi • Inattivazione del microrganismo • Vaccini contro pertosse, colera, febbre tifoide e antipolio • Hanno alcuni svantaggi: inducono poca immunità cellulo-mediata, causano frequenti effetti avversi REAGENTI CHIMICI (formaldeide, aldeide glutarica) CALORE

38. VACCINI UCCISI: i tossoidi • Alcuni batteri producono tossine • Alcuni vaccini sono costituiti da tossine sottoposte a trattamento chimico per eliminare le proprietà tossiche = TOSSOIDI • Tale preparazione ha immunogenicità relativamente scarsa, si può migliorare adsorbendo il tossoide su una sospensione di sali di alluminio • Con le tecnologie moderne le tossine possono essere detossificate con mutagenesi sito-diretta, questo garantisce la riproducibilità della proteina mutante e mantiene l’immunogenicità (es: tossina della pertosse)

39. Toxin Toxoid chemical modification toxin moiety antigenic determinants PRODUZIONE DI UN TOSSOIDE

40. VACCINI COSTITUITI DA UN TOSSOIDE: meccanismo d’azione

41. How has the vaccine industry changed in the last several years? This industry that used to be regarded as high volume, low value, low price has been transformed into an extremely high-value, first-world-focused industry. That's come about through the realization that vaccination is an extremely cost-effective health care intervention and through the development of new products for diseases that are a heavy health burden, such as influenza and early childhood diseases. Some of these new vaccines have become $1 billion-plus blockbusters for large pharmaceutical companies. In the last few years, the vaccine industry has seen a wave of consolidation driven by Big Pharma, and in my view, this is likely to continue. In addition we have also seen the emergence of strong regional players in the emerging markets such as India and China, as well as greater collaboration between the public and private sectors. ForbesintrviewtoStaphLeavenworthBakali 2009

42. What opportunities and innovations do you see in the industry today? Some of the big advances in vaccine research are new ways to discover novel vaccines, manufacturing technologies and delivery systems. In the past, vaccines were always administered through a needle. Now, people are working on needle-free delivery, including skin patches, oral vaccines, intranasal sprays and even vaccination via food.

43. 3a 3b VACCINI VIVI ATTENUATI: nuove tecnologie Pathogenic virus Isolate virulence gene 2 1 Mutate virulence gene Delete virulence gene • L’attenuazione non deve deprimere l’azione immunogena • Si deve escludere il ritorno alla virulenza del microrganismo non mutazioni fini

44. I VACCINI A BASE DI POLISACCARIDI I semplici polisaccaridi capsulari sono antigeni scarsamente immunogeni e manifestano scarsa memoria immunologica Il loro carattere immunogeno cresce di molto se si accoppiano chimicamente a proteine vettrici contenenti epitopi in grado di attivare cellule T Tra gli esempi di vaccini coniugati di terza generazione abbiamo i vaccini polisaccaridici contro l’ Haemophilus influenzae di tipo b (ProHIBiT), recentemente introdotti in molti programmi nazionali di immunizzazione. Esso è costituito dai polisaccaridi capsulari del virus Haemophilus influenzae legati covalentemente al tossoide della difterite

45. NUOVE TECNOLOGIE PER LA PRODUZIONE DI VACCINI-1 • 1- VETTORI VIVI: per migliorare la sicurezza e l’efficacia dei vaccini si usano come vettori per gli antigeni, virus o batteri vivi inoffensivi • Il virus più utilizzato a questo scopo è il virus vaccino grazie ad alcune caratteristiche: • Sicurezza nell’uomo • Possibilità di espressione immunogena multipla • Facilità di produzione • Relativa termoresistenza • Adattabilità a varie modalità di somministrazione

46. Vaccinia promoter UTILIZZO DEL VIRUS VACCINO COME VETTORE Vaccinia virus Foreign gene DNA Foreign gene Ligation Transfection Infection TK gene Tissue culture cells Homologous recombination Antibiotic selection resistance marker Foreign gene TK-negative recombinant virus

47. NUOVE TECNOLOGIE PER LA PRODUZIONE DI VACCINI-2 2- PROTEINE ESPRESSE NELLE CELLULE OSPITI Per aumentare la resa, facilitare la produzione e migliorare la sicurezza dei vaccini di proteine, spesso si fanno esprimere gli antigeni proteici in cellule ospiti facilmente manipolabili e che assicurino alti livelli di espressione. Tra gli ospiti ETEROLOGHI: lieviti, batteri e linee cellulari di mammifero

48. Choice of an Expression System Pros & Cons

49. I VACCINI ANTICORPALI ANTI-IDIOTIPO Si basa sul concetto di evocare anticorpi contro il sito di legame per l’antigene dell’anticorpo protettivo Il metodo è particolarmente interessante per epitopi non proteici come carboidrati, difficili da isolare e da produrre in grandi quantità, oppure residui a struttura zuccherina di lipopolisaccaridi o glicoproteine tossiche Il principale inconveniente è che la porzione strutturale dell’anticorpo anti-idiotipo non ha relazione con la struttura dell’antigene originale, per questo se non si usano Ab umani può dare luogo a reazioni immunitarie.

50. I VACCINI BASATI SU PEPTIDI DI SINTESI-1 Si determinano gli epitopi immunogeni, si sintetizza chimicamente la piccola sequenza lineare peptidica che servirà da componente del vaccino. Si applica solo agli EPITOPI CONTINUI determinati unicamente dalla sequenza aminoacidica primaria. Per gli EPITOPI DUISCONTINUI si sintetizzano migliaia di peptidi a caso, poi si selezionano quelli che si legano in modo ottimale agli anticorpi protettivi