Estrategias de Secuenciación de Genomas

1. Estrategias de Secuenciación de Genomas José Guillermo Dávila Ramos Centro de Ciencias Genómicas, UNAM

2. Secuenciación del DNA Principios y Métodos más empleados

5. Genomas Secuenciados • En años recientes, se ha logrado la secuenciación a gran escala del genoma de organismos eucariotes • Los 5 primeros genomas secuenciados de organismos pluricelulares son: • 1998 Caenorhabditis elegans - 8 x 107 pb - un nemátodo • 2000 Homo sapiens - 3 x 109 pb - el Humano • 2000 Arabidopsis thaliana - 1.15 x 108 pb- una planta • 2000 Drosophila melanogaster - 1.65 x 108 pb - la mosca de la fruta • 2002 Anopheles gambiae - 2.78 x 108 pb - el mosquito vector de la malaria

6. Secuenciación Tipo Sanger • El método de secuenciación de Sanger aprovecha la forma normal de la replicación del DNA • Para extender la cadena de DNA, usando la DNA polimerasa, deberá estar presente un grupo hidroxilo en el carbono 3’ de la deoxiribosa • Los fragmentos se generan al agregar pequeñas cantidades de 2’ 3’ dideoxinucleótidos a la reacción lo que interrumpe la polimerización cada vez que son incorporados en la cadena de DNA • La polimerasa usada deberá de carecer de la actividad de la exonucleasa de corrección 3’ > 5’ para que funcione el método

7. OH Fosfato NH2 HO O P Base N N O N N CH2 5’ O 4’ 1’ Azucar 3’ 2’ OH H H 2’3’-dideoxinucleótido monofosfato Dideoxinucleótidos 2’-deoxinucleótido monofosfato • La secuenciación de DNA usando el método de Sanger emplea 2’3’-dideoxinucleótidos trifosfatados ademas de los normales 2’-deoxinucleótido trifosfatado • Ya que los 2’3’-dideoxinucleótidos trifosfato carecen del grupo 3’ hidroxilo, y la polimerización del DNA ocurre solo en la dirección 3’, cada vez que un 2’3’-dideoxinucleótido trifosfato es incorporado la extención se detiene

8. CH3 O H OH HN N OH NH2 O P HO O O CH2 N N O O N N CH2 O OH P O OH NH2 B A S E S H O N H2N H O H P HO O N O N N 2’3’dideoxinucleótido NH O ESQUELETO AZUCAR-FOSFATO N N O H2O NH2 N O O CH2 N O CH2 N O HN N O HO P H2N H O O H H P HO O O CH2 O O CH2 O O HO P OH H HO Los 2’3’dideoxi-nucleótidosterminanla síntesis del DNA

10. fragmento Clonado Prímero Sitios de Prímeros Secuenciación de DNA Plásmido con un fragmento clonado de DNA

11. Pol. Pol. Pol. Pol. 5’TTATCGTACCATGACTAGA 5’TTATCGTACCATGA 5’TTATCGTA 5’TTATCGTACCATGACTAGATGCGATA Ya no puedes! Otra vez! No De nuevo! A que la! 5’TTATCGTACCA 5’TTATCGTACCATGACTA 5’TTATCGTACCATGACTAGATGCGA La Reacción con ddATP 3’AATAGCATGGTACTGATCTTACGCTAT5’ 5’TTATCG 5’TTATCGTA 5’TTATCGTACCATGA 5’TTATCGTACCATGACTAGA 5’TTATCGTACCATGACTAGATGCGATA

12. Separación de los Fragmentos • Todos los métodos actuales de secuenciación requieren que la separación de los fragmentos de DNA detecten diferencias en longitud de una base • Esto se logra por una electroforesis ya sea en geles de poliacrilamida o en capilares con polímeros líquidos

13. ddATP ddCTP ddGTP ddTTP Lectura 5’ a 3’ desde la basa al tope Separación de Fragmentos (Sanger) • Los productos de las 4 reacciones, cada una conteniendo una pequeña cantidad de uno de los cuatro dideoxinucleótidos, son cargadas en el gel y sometidas a electroforesis • Como la polimerización es solo en dirección 5’ a 3’, los fragmentos más cortos estarán en 5’ y los más largos que se encontrarán en la dirección 3’

14. Applied Biosystems • Applied Biosystems (ABI) ha desarrollado colorantes fluorescentes más sensibles, mejorado el método de cargado de la muestra y la electroforesis • Cuatro colorantes que fluoresen a una longitud de onda distinta, pero con el mismo impacto en la movilidad electroforética, pueden ser usados para marcar ya sea los prímeros o los nucleótidos que terminan la reacción • Si se usan los dideoxinucleótidos fluorados, la reacción de secuenciación completa se realiza en un solo tubo • En lugar de los geles de poliacrilamida, se emplea un solo capilar con un polímero líquido que se remplaza al final de cada corrida

15. Pol. Pol. Pol. Pol. 5’TTATCGTACCAC 5’TTATCGTACCATAATT 5’TTATCGTACCATAATTGCA 5’TTATCGTA Let me Through! Oh come on! Not Again! Agggg…. 5’TTATCGTAT 5’TTATCGTATT 5’TTATCGTATTG 5’TTATCGTATTGCA 5’TTATCGTATTGCAA 5’TTATCGTATTGCAAT 5’TTATCGTATTGCAATTG 5’TTATCGTATTGCAATTGC Secuencia con Terminadores Fluorados 3’AATAGCATAACGTTAACGTTACGCTAT5’ 5’TTATCG 5’TTATCGTA Como la base al final de cada fragmento esta marcada con un fluoróforo único, la reacción total se puede hacer en un solo tubo 5’TTATCGTATTGC 5’TTATCGTATTGCAATT 5’TTATCGTATTGCAATTGCA

16. ATTGCA Capilar Pol. líquido - Placa caliente Laser Big Hairy Prisma Computer Reacción Secuencia ….. Ventana Detectores Sistema Prisma 310 ABI +

17. ABI Prism 3700 El ABI Prisma 3700

18. El Estado del Arte • El ABI Prisma 3730XL, representa la última generación de equipos de secuenciación capilar automática • El 3730XL puede secuenciar hasta 1,500,000 de bases diarias • Con esta capacidad el genoma de una bacteria de 5,000,000 de pares de bases, puede ser totalmente secuenciado en un mes • El desarrollo más reciente es la piro-secuencia, que incrementa en un orden de magnitud el número de bases obtenidas por día

19. Estrategias para la Secuenciación de Genomas Secuenciación al Azar y Secuenciación Jerárquica al Azar

20. Método de Secuenciación al Azar Genoma Secuenciación y alineamiento de los insertos Fragmentación ATTCGCTGGCGGT TTGCTGCAAAATTG CGGTATTGCGCTTGCTGC Refinamiento clonación ATTCGCTGGCGGTATTGCGCTTCTGCAAAATTG Secuencia final Plásmido Genoteca del genoma

21. Secuenciación Jerárquica al Azar BAC Genoma 2. Clonación 1. Fragmentación Genoteca de BACs 4. Secuenciación y alineamiento de los insertos de cada BAC 3. Secuencia de los bordes de los insertos de los BACs y alineamiento para crear un mapa de CONTIGS ATTCGCTGGCGGT TTGCTGCAAAATTG CGGTATTGCGCTTGCTGC Refinamiento ATTCGCTGGCGGTATTGCGCTTCTGCAAAATTG Secuencia final

22. H2O H2O CO2 O2 O2 N2 N2 NH4+ Rizósfera nódulo Rhizobium suelo

23. Plásmidos Cromosoma circular El Genoma de Rhizobium etli f e d c a b = plásmido simbiótico

24. El primer genoma completo hecho en México