Szöveti regeneráció (3)

1. Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

2. Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissueengineering” – 19. Előadás Szöveti regeneráció (3)

3. Szívelégtelenség Az egyik leggyakoribb betegség Nagy morbiditás és mortalitási ok a fejlett országokban Okok: Veleszületett rendellenességek Magas vérnyomás Szívinfarktus Mérgek, toxinok Fertőzések

4. Szívizom regenerációs terápiák A szívizom regenerációját célzó terápiák a kutatások fókuszában vannak: A szívelégtelenség előfordulása egyre gyakoribb az életkor előrehaladásával A fejlett országokban a populáció egyre inkább öregszik A szívinfarktust túlélő betegek száma növekszik A legtöbb MI túlélő szívelégtelenségben szenved

5. LVAD • A bal kamra pumpafunkcióját segíti • Pulzálás vagy • Folyamatos pumpálás • 7 év az LVAD-al viselési rekord

6. Bal kamra kisegítő eszközök Szívtranszplantációra váró betegekben: A megfelelő donor megtalálásáig életben tartja a szívelégtelenségben szenvedő beteget A kezelés maga is segíti a sérült szívizom regenerációját Javítja az életminőséget Transzplantációra alkalmatlan betegeknél: Palliatív terápia Javítja az életminőséget Szövődmények lehetnek: Infekció veszélye Alvadási rendellenességek veszélye Embolizáció veszélye

7. Csontvelő Mesenchimális őssejtek Hemopoetikus őssejtek Sidepopulation sejtek Csontvelői sejtek a szívizom regenerációban Vázizom Szatellita sejtek Sidepopulation sejtek Vérerek Endotélprogenitor sejtek (hemangioblasztok) Szív Sidepopulation sejtek Kit+ sejtek Sca-1+ sejtek Fúziós és nem-fúziós differenciációs út

8. Sejtes terápiás lehetőségek a szívizom-regenerációban I. Csontvelői sejtek (BMC) Hemopoetikusőssejtek részt vehetnek a szívizom regenerációjában Intenzíven tanulmányozott terület állatkísérletes modellekben különböző módon jelölt BMC-kkel Eltérő nemű donortől származó graftok betegekben Sérülés után BMC homing tapasztalható a sérült területre GCSF moblizáció nem reprodukálja a BMC helyi injektálásának eredményeit

9. Sejtes terápiás lehetőségek a szívizom-regenerációban II. Intravenás infúzió Szelectívintrakoronáriásinfusion Direkt intramiocardiális injekció Fúzió a residenskardiomiocitákkal Differenciáció a szívre jellemző fenotípussá Parakrin faktorok szekréciója Differenciáció érfal komponensekké Perivaskulárisinkorporáció ↓Kardiomiocitaapoptosis Rezidens őssejtek toborzása Kardiomiocitaproliferáció Matrix: Hegszövet kompozíció Granulációs szövet Pro-angiogéncytokinek Angiogénligandok ↑Funkcionális kardiomiociták száma ↑Perfúzió ↑Szív teljesítménye

10. Sejtes terápiás lehetőségek a szívizom-regenerációban III. BMC transzdifferenciációjára szívizomsejtekké nincs direkt bizonyíték Ha egyáltalán előfordul, nagyon ritka esemény Talán az egyetlen nyilvánvaló terápiás előny a sérült szívizomszövet megnövekedett vaszkularizációja, amely a saját regenerációs kapacitást növeli.

11. Sejtes terápiás lehetőségek a szívizom-regenerációban IV. A szívizomsejtek megtartott osztódási képessége bizonyított tény Többfajta őssejt-markereket (Sca-1, CD31) és szívizom-markereket expresszáló, proliferáló sejttípus mutatható ki a szívizomban 5-azacitidin-indukálta sérülés után Rágcsálókban és emberekben is kimutatható Jó proliferációs képesség

12. Szívizom sejtes terápiája • Szívizomsejt • Egy sejtmag (centrális) • Gapjunction (+) • Cx43 expresszió (+) • Vázizomrost • Sokmagvú (perifériás) • Gapjunction (-) • Cx43 expresszió (-) ??? • Myotubulus • Sokmagvú • Gapjunction (-) • Cx43 expresszió (-) • Myoblaszt • (szatellita sejt) • Egy sejtmag • Gapjunction (+) • Cx43 expresszió (+) • Proliferáció (+) Fúzió és differenciáció

13. Vázizom myoblasztok Biopsziából származó vázizom mioblasztokat alkalmaztak korai stádiumú klinikai kipróbálás során Szívizom teljesítmény és életminőség növekszik: Csökken a NO szükséglet Javul az NYHA besorolás Javul a fizikai terhelhetőség A betegeknél kamrai aritmiák fordultak elő Néha ICD beültetése vált szükségessé A vizsgálatokban részt vett betegek száma alacsony volt Nem volt kezeletlen kontroll csoport ezekben a vizsgálatokban

14. Embrionális őssejtek • A szívizommá differenciálódási képesség bizonyított • hESC-eket beültetés előtt differenciáltatni szükséges • A sérülés önmagában nem indukálja a hESC növekedését és a szívizommá való differenciációt, sőt, gyulladásos citokinek károsíthatják a beültetett sejteket • Gyulladáscsökkentő és más védő anyagok alkalmazása szükséges a grafttámogatásához (IGF-1, pán-kaszpáz inhibitorok és NO blokkolók) • A differenciálódott szívizomsejtek immunválaszt váltanak ki immunkompetens egerekben. • Teratoma kialakulása is kockázatot jelent. Jelenleg kérdéses a klinikai alkalmazás jövője.

15. Tissue engineering megoldások fogpótlásban A fogazat nagyon fontos a gerincesek táplálkozásában A fogzási rendellenességek vagy a hiányos szájhigiéné nem életet veszélyeztető kondíció a fejlett országokban Ennek ellenére a fogazat károsodása és betegségei jelentősen csökkentik az életminőséget

16. Fogfejlődés • Kölcsönös jelátviteli események az epitéliumés az alatta lévő mesenchyma között • Amorfogenezis és a végleges differenciáció megkezdődése • Csíra szakasz • Epitéliálissapka szakasz (körbeveszi a mesenchymát) • Harang szakasz • Koronai szakasz Fogkorona Dentin Odontoblaszt Zománc Pulpaüreg Cement Fogíny rost Periodontális membrán Sharpeyrost Fogágy csont Foggyökér Vérér Idegrost

17. Fogbél eredetű őssejtek (DPSC) A DPSC-kmultipotens sejtek a fogbélben (pulpadentis) Fontos szerep a dentin sérülés utáni regenerációjában Odontoblasztok jelennek meg a sérülés helyén Differenciálatlan mezenchymális sejtek folyamatosan vándorolnak a mélyebb rétegekből a dentin felé és odontoblaszt irányú differenciáció figyelhető meg Kísérleti bizonyítékok utalnak arra, hogy a migráló sejtek a DPSC-k.

18. A DPSC-kdifferenciációs képessége Emberi DPSC-k tenyésztése mineralizációt serkentő körülmények között A sejtek odontoblaszt-szerű sejtekké differenciálódnak, dentint termelnek és nestin-pozitívak A DPSC-kfenotípusosanaz MSC-kre emlékeztetnek, de a dentin-termelő képességük egyedi

19. Tissueengineering a fogpótlásban Fogképző sejtek screenelése Sejt ko-kultúra 3D körülmények között Fogcsíra szövetkonstrukció transzplantációja Epitéliális sejtek Fogcsíra szövetkonstrukció Betegből izolált őssejtek Mezenchymális sejtek A transzplantált szövetkonstrukció foggá fejlődik In vitro tenyésztett fogkonstrukció Transzplantáció

20. Fog előállítása mesterséges körülmények között I. Scaffold-alapú foggyökér: Biokompatibilis anyagból készült gyökér-implantátum, amelyre mesterséges (pl. porcelán) koronát rögzítenek A sejtek belenőnek a scaffold anyagába, így biztosítják a rögzítést Sertés állatmodellen végzett kísérletek bizonyítják a megvalósíthatóságot

21. Fog előállítása mesterséges körülmények között II. Az embrionális fogfejlődés mesterséges reprodukálása: Az embrionális fogfejlődés tökéletesen azonos funkciójú fogat eredményez A foggyökér és a korona is kifejlődik Rágcsáló kísérletek sikeresek voltak Nem csak embrionális, hanem újszülött vagy felnőtt eredetű sejtek is képesek voltak a fog kinövesztésére Scaffoldalapú és scaffoldmentes rendszerek is kipróbálásra kerültek

22. Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissueengineering” – 20. Előadás Szöveti regeneráció (4)

23. Húgyivari szervek sérülésének okai Húgyivari szervek sérülései vagy funkcióvesztése: Fejlődési rendellenességek Trauma Fertőzés, gyulladás Orvosi beavatkozás mellékhatása (iatrogén ok)

24. Megoldások a húgyivari szervek szöveti regenerációjában • Saját nem-húgyivari eredetű szövetek: • Bőr • Gasztrointeszinális eredetű szövetek • Más szervekből kivett nyálkahártya • Allogén eredetű szövetek: • Kadáver vagy élődonoros eredetű vesegraft • Kadáver eredetű fascia • Xenogén anyagok: • Szarvasmarha kollagén • Mesterséges anyagok: • Szilikon • Polyuretán • Teflon

25. Sejtek izolálása szöveti regeneráció céljára Autológ vagy allogén Végstádiumú szervelégtelenség gyakran behatárolja a szöveti regenerációra alkalmas sejtek mennyiségét In vitro tenyésztési eredmények különbözőek: In vitro tenyészett hólyag simaizomsejtek: alacsony kontraktilitás Alacsony sejtszám behatárolja a regenerációs lehetőségeket Őssejtek jelenthetik a megoldást Terápiás klónozás is megoldást jelenthet

26. Bioanyagok a húgyivari szervek rekonstrukciójában I. Mesterséges anyagok ECM funkciók pótlása: 3D struktúra kialakítása a szövet kialakulásának támogatására Sejtdifferenciáció szabályozása és serkentése bioaktív molekulák tárolása és leadása útján Sejtek injektálása a megfelelő scaffold támogatása nélkül nem eléggé hatékony

27. Bioanyagok a húgyivari szervek rekonstrukciójában II. Természetes eredetű bioanyagok Kollagén Alginát Sejtmentes szöveti alapanyagok: Hólyagi submucosa Vékonybél submucosa (SIS) Szintetikus polimerek PLA, PGA, PLGA

28. Urothelium – különleges funkciók Kiválasztó, nem felszívó funkció Jelenlegi sebészeti rekonstrukciós megoldások a gasztrointesztinálisautograftokat részesítik előnyben a húgycső, húgyvezeték vagy a hólyag sérüléseinek a rekonstrukciójában Az intesztinális hám és az urothelium különböző szerkezete és funkciója gyakran okoz mellékhatásokat, amelyeknek súlyos következményeik is lehetnek

29. Húgycső rekonstrukció I. Szűkületek, sérülések, trauma, fejlődési rendellenességek (pl. hypospadiasis) Leggyakrabban a bukkális nyálkahártyát használják graftként a rekonstrukciós sebészetben: A graftot a pofa vagy az ajkak belső felszínéről veszik A hám vastag és a nyálkahártya erezete gazdag Emiatt a graft ellenálló a fertőzésekkel szemben

30. Húgycső rekonstrukció II. Hólyag-eredetű urotélium: Megfelelőnek bizonyult a rekonstrukcióban nyulakban Klinikai kipróbálás eddig nem volt Sejtmentes kollagén szövetek: Az anyag szükség szerint rendelkezésre áll Az eredmények jók a „csak” rekonstrukciós sebészeti megoldások esetében A szűkületek gyakoriak, ha a húgycsövet teljes átmérőjében, tubularizáltan kell rekonstruálni

31. Húgycső rekonstrukció III. Sejtmentesített és tubulárisscaffoldkonstruktok, amelyekre autológurotéliumotnövesztettek: Állatkísérletes eredmények biztatóak A szövetkonstrukciók hisztológiai szerkezete a natív urotéliumhozhasonlatos Kollagén scaffold sejtek kiültetése nélkül szűkületet eredményezett

32. Hólyag rekonstrukció I. Leggyakrabban intesztinális eredetű nyálkahártyát használnak rekonstrukcióra: Az intesztinális hám különbözik az urotéliumtól Az intesztinális hám szerepe a táplálék abszorpció és a nyákszekréció Szövődmények: infekció, vesekő, anyagcsere rendellenességek, perforáció, megnövekedett nyákszekréció, rosszindulatú daganatok kialakulása Az ellentmondásos eredmények miatt alternatív terápiás lehetőségek felé fordult az érdeklődés

33. Hólyag rekonstrukció II. Hólyag megnagyobbító megoldások: A húgyhólyag progresszívdilatációja a leggyakrabban alkalmazott konzervatív megoldás Augmentációscisztoplasztika: a hólyag megnagyobbítása húgyvezeték-eredetű urotéliummal Jobb eredmények érhetőek el ezzel a megoldással, mint a gasztrointesztinális eredetű graftokkal

34. Hólyag rekonstrukció III. Sejtmentes ECM-eredetű anyagok: Xenogén SIS → sejtmentesített kollagén-alapú szöveti mátrix → nincsen mukózális izomréteg (str. muscularismucosae) A graft hámosodása rendben lezajlott Az izomréteg miatt a kontrakciós compliance akadályoztatott Scaffold-okra ültetett hám- és simaizomsejtek: Az izomréteg sikeresen kialakult, a kontrakciós compliance megfelelő Scaffold-ok: PGA és kollagén kombinációja

35. Húgyvezeték rekonstrukció • Húgyvezeték rekonstrukció állatokban: • Sejtmentes scaffold-ok beültetésével sikeres volt a húgyvezeték fal minden rétegének a regenerációja patkányokban • Merev anyagokból készült csövek (teflon)beültetése nem bizonyult sikeresnek kutyákban • 3cm hosszú csőszerű sejtmentes scaffold-ok beültetése kutyákban szűkület kialakulásához vezetett • Sejtes scaffoldok beültetése sokkal kielégítőbb eredményekhez vezetett kutyakísérletekben

36. Vesepótló kezelések Jelenleg rutinszerűen két típusú kezelést alkalmaznak a végstádiumú veseelégtelenség (ESRF) kezelésében: Művesekezelés (Dialízis) Vesetranszplantáció

37. Dialízis • Hemodialízis, hemofiltráció • Dializátorok: szintetikus anyagból készült porózus rostok alkalmazása a leggyakoribb • Alvadásgátoltvénásvérteresztenekát a dializálóberendezésen, ellenáramúdializálóoldatotalkalmaznak • Hasi (Peritoneális) dialízis • A dializáló oldatot katéteren keresztül a hasüregbe vezetik • A toxikusmetabolitokés a felhalmozódott víz eltávolítása a betegből a plazma és a dializáló folyadék közötti ozmotikus különbségeken alapul • Szív- és érrendszeri, metabolikus és mozgásszervrendszeri szövődmények előfordulása gyakori

38. Vesetranszplantáció A leggyakrabban átültetett parenchimás szerv Kadáver vagy élő donor A dializált betegekhez képest jelentősen javul az életminőség Allogén eredetű graft beültetése után immunszupresszív kezelés szükséges Az immunszuppresszív kezelés mellékhatásai: fertőzések és malignus daganatok kialakulására való hajlam növekedése, máj- és vesetoxicitás, szív- és érrendszeri, valamint metabolikus mellékhatások

39. TE vese előállítása I. Bioartificiális megközelítés: A dializáló gépek helyettesítése biológiai művesével Extrakorporeális és beültethető változatok is Preklinikaikísérletek kutyákon sertés vese tubulus sejtekből kialakított biológiai művesével: sikeres karbamid és kálium-szint kontroll Legnagyobb hátrány: a beteg még így is géphez kötve éli az életét

40. Biológiai művese Rostok fala Hőcserélő Pumpa 2 5-7 ml/min Lumen Proximálistubulus sejtek 5-10 mm Hg RAD dializátor Extrakapilláris tér Pressure monitor Szürlettartály 10-25 mm Hg Hőcserélő Feldolgozott szűrlet (vizelet) Hemofilterből jövő vér (RAD extrakapilláris térbe) Dializátorból jövő vér Plazmapótló folyadék Ultrafiltrátum (RAD lumenbe) Hemofilter Pumpa 3 70-80 ml/min Pumpa 1 80 ml/min Vénás vér

41. TE vese előállítása II. In vivo megközelítés: Humán vesesejteket tubuláris polikarbonát scaffoldkonstrukcióra ültettek Immundeficiens egérbe való beültetés során megfelelő sűrűségű érhálózat alakult ki Vizeletszerű folyadék termelése: karbamid és kreatinintartalom A hámsejtek tubulárisdifferenciáció jeleit mutatták

42. In vitro előállított egér vese Sejtek Bimbó Bimbó Wolff cső Sejtek Metanefrikus mesenchyma 4-6 nap