Recherche et optimisation des amorces pour PCR

1. Recherche et optimisation des amorces pour PCR Etape cruciale de la réussite de la PCR Les amorces doivent être spécifiques, stables et compatibles

2. 5’-TGATACATCGCCGTCGTCGT GCG-3’||| 5’-CGACGGACGA Critères de qualité • Spécificité • taille : 18 à 30 nt - contenu en GC : 40 à 60%- séquence spécifique à la zone d’intérêtStabilité • faible formation de dimères • faible formation de structures secondaires - extrémité 3’ : présence de quelques bases GC en 3’, mais pas en grand nombre car risque de « false priming » • Compatibilité • - Différence Tm < 2°C

3. Amorce gauche et amorce droite Peut être déterminé à l’aide de SMS2 Sequence Manipulation Suite 2

4. Exercice Recherche du gène invA de Salmonella typhimurium dans GENBANK Recherche d’amorces simples et vérification de leur qualité Recherche d’amorces avec Primer3 Recherche d’amorces avec PerlPrimer

5. Séquence du gène invA de Salmonella typhimurium >gi|154154|gb|M90846.1|STYINVA Salmonella typhimurium InvA (invA)GATATTGCCTACAAGCATGAAATGGCAGAACAGCGTCGTACTATTGAAAAGCTGTCTTAATTTAATATTA ACAGGATACCTATAGTGCTGCTTTCTCTACTTAACAGTGCTCGTTTACGACCTGAATTACTGATTCTGGT ACTAATGGTGATGATCATTTCTATGTTCGTCATTCCATTACCTACCTATCTGGTTGATTTCCTGATCGCA CTGAATATCGTACTGGCGATATTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGACAGAATCCTCAGTTTTTCAA CGTTTCCTGCGGTACTGTTAATTACCACGCTCTTTCGTCTGGCATTATCGATCAGTACCAGTCGTCTTAT CTTGATTGAAGCCGATGCCGGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAATTCGTTATTGGCGATAGCCTGGCG GTGGGTTTTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCCAGTTTATCGTTATTACCAAAGGTTCAGAACGTG TCGCGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGATGGTATGCCCGGTAAACAGATGAGTATTGATGCCGATTT GAAGGCCGGTATTATTGATGCGGATGCCGCGCGCGAACGGCGAAGCGTACTGGAAAGGGAAAGCCAGCTT TACGGTTCCTTTGACGGTGCGATGAAGTTTATCAAAGGTGACGCTATTGCCGGCATCATTATTATCTTTG TGAACTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGGGATGACTCGCCATGGTATGGATTTGTCCTCCGCCCTGTCTAC TTATACCATGCTGACCATTGGTGATGGTCTTGTCGCCCAGATCCCCGCATTGTTGATTGCGATTAGTGCC GGTTTTATCGTGACCCGCGTAAATGGCGATACGGATAATATGGGGCGGAATATCATGACGCAGCTGTTGA ACAACCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCTATTTTGACCATTTCAATGGGAACTCTGCCGGGATTCCCACT GCCGGTTTTTGTTATTTTATCGGTGGTTTTAAGCGTACTCTTCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACGT AGCGCCGCCAAACCTAAAACCAGCAAAGGCGAGCAGCCGCTCAGTATTGAGGAAAAAGAAGGGTCGTCGT TAGGACTGATTGGCGATCTCGATAAAGTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAG CCGGCGTGAAGATCTGGAAAAAGCTCAACTTGCGGAGCGTCTACGTAGTCAGTTCTTTATTGATTATGGC GTGCGCCTGCCGGAAGTATTGTTACGAGATGGCGAGGGCCTGGACGATAACAGCATCGTATTGTTGATTA ATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCTATTTTGATTTGATGCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT CGTGTCCTTTGGTATTAATCCAACAATCCATCAGCAAGGTAGCAGTCAGTATTTCTGGGTAACGCATGAA GAGGGGGAGAAACTCCGGGAGCTTGGCTATGTGTTGCGGAACGCGCTTGATGAGCTTTACCACTGTCTGG CGGTGACCGTGGCGCGCAACGTCAATGAATATTTCGGTATTCAGGAAACAAAACATATGCTGGACCAACT GGAAGCGAAATTTCCTGATTTACTTAAAGAAGTGCTCAGACATGCCACGGTACAACGTATATCTGAAGTT TTGCAGCGTTTGTTAAGCGAACGTGTTTCCGTGCGTAATATGAAGTTAATTATGGAAGCGCTCGCATTGT GGGCGCCAAGAGAAAAAGATGTCATTAACCTTGTGGAGCATATTCGTGGAGCAATGGCGCGTTATATTTG TCATAAATTCGCCAATGGCGGCGAATTACGAGCAGTAATGGTATCTGCTGAAGTTGAGGATGTTATTCGC AAAGGGATCCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTCAGCCTTGACCCGGAAGCCTCCGCTAATTTGATGG ATCTCATTACACTTAAGTTGGATGATTTATTGATTGCACATAAAGATCTTGTCCTCCTTACGTCTGTCGA TGTCCGTCGATTTATTAAGAAAATGATTGAAGGTCGTTTTCCGGATCTGGAGGTTTTATCTTTCGGTGAG ATAGCAGATAGCAAGTCAGTGAATGTTATAAAAACAATATAAGGGCTTAATTAAGGAAAAGATCTATGCA ACATTT Séquence cible à amplifier (300 nt) Séquence du gène au format FASTA

6. Amorces non optimisées Amorces déduites des séquences en amont et en aval >gi|154154|gb|M90846.1|STYINVA Salmonella typhimurium InvA (invA) GATATTGCCTACAAGCATGAAATGGCAGAACAGCGTCGTACTATTGAAAAGCTGTCTTAATTTAATATTA ACAGGATACCTATAGTGCTGCTTTCTCTACTTAACAGTGCTCGTTTACGACCTGAATTACTGATTCTGGT ACTAATGGTGATGATCATTTCTATGTTCGTCATTCCATTACCTACCTATCTGGTTGATTTCCTGATCGCA CTGAATATCGTACTGGCGATATTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGACAGAATCCTCAGTTTTTCAA CGTTTCCTGCGGTACTGTTAATTACCACGCTCTTTCGTCTGGCATTATCGATCAGTACCAGTCGTCTTAT CTTGATTGAAGCCGATGCCGGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAATTCGTTATTGGCGATAGCCTGGCG GTGGGTTTTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCCAGTTTATCGTTATTACCAAAGGTTCAGAACGTG TCGCGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGATGGTATGCCCGGTAAACAGATGAGTATTGATGCCGATTT GAAGGCCGGTATTATTGATGCGGATGCCGCGCGCGAACGGCGAAGCGTACTGGAAAGGGAAAGCCAGCTT TACGGTTCCTTTGACGGTGCGATGAAGTTTATCAAAGGTGACGCTATTGCCGGCATCATTATTATCTTTGTGAACTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGGGATGACTCGCCATGGTATGGATTTGTCCTCCGCCCTGTCTAC TTATACCATGCTGACCATTGGTGATGGTCTTGTCGCCCAGATCCCCGCATTGTTGATTGCGATTAGTGCC GGTTTTATCGTGACCCGCGTAAATGGCGATACGGATAATATGGGGCGGAATATCATGACGCAGCTGTTGA ACAACCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCTATTTTGACCATTTCAATGGGAACTCTGCCGGGATTCCCACT GCCGGTTTTTGTTATTTTATCGGTGGTTTTAAGCGTACTCTTCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACGT AGCGCCGCCAAACCTAAAACCAGCAAAGGCGAGCAGCCGCTCAGTATTGAGGAAAAAGAAGGGTCGTCGT TAGGACTGATTGGCGATCTCGATAAAGTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAG CCGGCGTGAAGATCTGGAAAAAGCTCAACTTGCGGAGCGTCTACGTAGTCAGTTCTTTATTGATTATGGC GTGCGCCTGCCGGAAGTATTGTTACGAGATGGCGAGGGCCTGGACGATAACAGCATCGTATTGTTGATTA ATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCTATTTTGATTTGATGCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT CGTGTCCTTTGGTATTAATCCAACAATCCATCAGCAAGGTAGCAGTCAGTATTTCTGGGTAACGCATGAA GAGGGGGAGAAACTCCGGGAGCTTGGCTATGTGTTGCGGAACGCGCTTGATGAGCTTTACCACTGTCTGG CGGTGACCGTGGCGCGCAACGTCAATGAATATTTCGGTATTCAGGAAACAAAACATATGCTGGACCAACT GGAAGCGAAATTTCCTGATTTACTTAAAGAAGTGCTCAGACATGCCACGGTACAACGTATATCTGAAGTT TTGCAGCGTTTGTTAAGCGAACGTGTTTCCGTGCGTAATATGAAGTTAATTATGGAAGCGCTCGCATTGT GGGCGCCAAGAGAAAAAGATGTCATTAACCTTGTGGAGCATATTCGTGGAGCAATGGCGCGTTATATTTG TCATAAATTCGCCAATGGCGGCGAATTACGAGCAGTAATGGTATCTGCTGAAGTTGAGGATGTTATTCGC AAAGGGATCCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTCAGCCTTGACCCGGAAGCCTCCGCTAATTTGATGG ATCTCATTACACTTAAGTTGGATGATTTATTGATTGCACATAAAGATCTTGTCCTCCTTACGTCTGTCGA TGTCCGTCGATTTATTAAGAAAATGATTGAAGGTCGTTTTCCGGATCTGGAGGTTTTATCTTTCGGTGAG ATAGCAGATAGCAAGTCAGTGAATGTTATAAAAACAATATAAGGGCTTAATTAAGGAAAAGATCTATGCA ACATTT Amorce gauche 5’-TTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’ Amorce droite 5’-CCGCCAATAAAGTTCACAAA-3’

7. Analyse de l’amorce gauche avec Netprimer Mauvaise amorce : formation d’épingle, de dimères

8. Analyse de l’amorce droite avec Netprimer Mais Tm très différent de l’amorce gauche Pas d’épingle, pas de dimères

9. Recherche d’amorces avec Primer3 http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm

10. Résultats avec Primer3 Plusieurs couples d’amorces sont proposés On remarque que le logiciel a trouvé d’autres amorces plus optimisées mais pas à la même position Légende ****** cible >>>>>> amorce gauche <<<<<< amorce droite

11. Recherche d’amorces avec PerlPrimer Il s’agit d’un logiciel libre téléchargeable Définir la région à amplifier Copier/coller la séquence Visualisation et analyse des amorces Visualisation de la séquence et des amorces Recherche des amorces

12. Résultats avec PerlPrimer Analyse de la qualité des amorces On peut réaliser un Blast directement pour vérifier la spécificité des amorces

13. Résultats de l’analyse avec Blast Les primers choisies s’alignenent en uniquement avec des séquences provenant de Salmonella