Busqueda de puentes de hidrogeno Un puente de hidrogeno (puente-H) permite que pedazos

1. Busqueda de puentes de hidrogeno • Un puente de hidrogeno (puente-H) permite que pedazos • del peptido relativamente distantes en la cadena queden • cerca uno de otro en el espacio. Son muy comunes en prote- • inas, y si se pudiese identificar donde estan (atomos dador y • aceptor), obtendriamos una restriccion estructural importante. • En una proteina los puentes-H mas interesantes son aquellos • entre los protones NH y carbonilos del esqueleto peptidico, • como ser los que vemos en a-helices y hojas b. Tambien po- • demos verlos de grupos NH y CO en cadenas laterales (Asn, • Asp, Gln, Glu) a grupos CO y NH del esqueleto peptidico: • Para ubicarlos estudiamos las velocidades de interecambio • de los protones NH. La idea es que protones labiles protegi- • dos del solvente no intercambian tan rapido con protones del • solvente como aquellos que esten expuestos al medio.

2. Velocidad de intercambio de amidas • Osea, si agregamos D2O a una solucion de nuestra proteina • en H2O y tomamos espectros a distintos tiempos vemos que • las señales de los NH desaparecen a distintas velocidades. • Como en la region NH de un espectro 1H 1D hay mucho so- • lapamiento, normalmente usamos un experimento 2D rapido, • como ser un COSY. Miramos las correlaciones NH-Ha a • distintos tiempos. 4.0 t = 0 (Sin D2O) Agregado de D2O t = t1 t = t2 4.0 (Has) 4.0 8.0 (NHs) 7.0

3. Intercambio de amidas (continuado) • Con estos datos podemos determinar que NH participan en • puentes-H fuertes y debiles, y cuales no participan. Como • tambien tenemos datos de NOE y acoples 3J podemos ver si • estas amidas pertenecen a regiones de la proteina con estru- • ctura secundaria definida (helices-a, hojas b, o bucles b). • Si y SOLO si podemos hacer eso, podemos usar al puente-H • como una restriccion estructural en la generacion del • modelo 3D. • ¿Porque el ‘SOLO’? Solo conocemos al dador del puente-H, • pero no hay, al menos hasta hace poco, forma de determinar • cual es el C=O aceptor. Si le erramos a esto, el resultado es • catastrofico: Como basicamente estamos ciclando el peptido • no hay forma de obtener la estructura correcta. • Si decidimos que es razonable, podemos usar los puentes-H • en los calculos como una restriccion de distancias: • rPH-ideal es ~2.5 Å. Como los puentes-H tambien tienen una • componente angular (el angulo N-H…O tiene que estar entre • 135 y -135), podemos hacer el termino EHBmas complejo • para incorporar esto tambien… EHB = KHB * ( ri - rHB-ideal )2

4. Gradientes de temperatura de amidas • Las velocidades de intercambio andan bien en proteinas, ya • que los tiempos son relativamente largos. En peptidos mas • chicos esto no siempre es asi. • Como son mas flexibles, tienen mucho mas contacto con el • solvente y todo se intercambia en tiempos mas cortos • (minutos en vez de horas). En el tiempo que nos lleva poner • D2O en el tubo, ir al laboratorio de RMN, ponerlo en el iman, • y ajustar el campo ya no tenemos NHs, sino que NDs… • En peptidos, en vez de estudiar velocidades de intercambio • analizamos el cambio en el corrimiento de los protones NH • en funcion de la temperatura (gradientes de temperatura). • Cuanto mas expuesto este el proton NH al solvente, mas • rapido sera su intercambio con los protones del agua, lo que • mueve su corrimiento quimico a campos altos (4.7 ppm…). • Medimos los gradientes de T en partes por billon (ppb). • Valores por debajo de -2 indican que estamos protegidos del • solvente, entre -2 y -5 ppb que estamos parcialmente protegi- • dos (tenemos puente-H parte del tiempo), y arriba de -6 que • el proton NH esta completamente expuesto al agua. • Como en proteinas, no podemos determinar cual es el acep- • tor (que oxigeno). Osea, tenemos que tener cuidado si que- • remos usar esta informacion para imponer restricciones…

5. Gradientes de temperatura de amidas (…) • Para el peptido Ala-Arg-Pro-Tyr-Asn-Aic-Cpa-Leu-NH2: • El NH de la Leu esta en un puente-H parcial.

6. Uso de VIAs y GTAs • Un problema de tener datos de puentes-H es saber que los • tenemos pero no poder usarlos con certeza. • Si queremos hacerlo con cuidado, hacemos todos los calcu- • los de las estructuras 3D con NOEs y 3Js, y despues descar- • tamos las estructuras en las que NHs que sabemos que es- • tan involucrados en puentes-H no aparezcan en puentes-H • (lease, lo usamos como una confirmacion). • Tambien los podemos usar directamente si tenemos datos • de NOE y 3Js complementatios, como ser en casos que ten- • gamos helices-a y hojas b bien definidos. El problema son • los bucles b, donde vemos puentes-H pero no NOEs/3Js. • O podemos hacer algo mas complicado, que es probar todos • los aceptores razonables posibles en simulaciones indepen- • dientes y ver cuales son los que nos dan menor energia: O O E1 O H O O O O O O H H E2 O O O H E3

7. Marcado isotopico • En principio, los unicos nucleos que podemos ver por RMN • en una proteina son los 1Hs. En proteinas chicas (~ 10 KDa, • ~ 80 aminoacidos) esto no es problema. Podemos identificar • todos los residuos, determinar todos los NOEs, y medir la • mayoria de los acoples 3J con TOCSYs, COSYs, y NOESYs. • En moleculas mas grandes (> 10 KDa), el solapamiento se • torna problematico. Muchos residuos quedan sin identificar, • y no podemos asignar partes del esqueleto peptidico. • Lo que necesitamos son mas nucleos con actividad de RMN. • De esa forma podriamos editar los espectros en base a ellos, • o agregar una tercera (y talvez cuarta) dimension. • Para poder hacer esto necesitamos varias cosas: • - Hay que conocer el gen responsible de la sintesis de la pro- • teina que nos interesa. • - Neceitamos a un biologo molecular que prepare un plas- • mido con el gen, si es posible usando E. coli como vector, • que crezca en medio minimo, de manera que cualquier • estudiante en el laboratorio pueda sobreexpresarlo. • - La proteina sobreexpresada tiene que ser funcional. El 85% • de las veces la proteina se sobreexpresa pero precipita… • - Un protocolo bueno/bonito/barato de purificacion.

8. A A 2 1 5 1 3 1 3 1 5 1 3 N C C N C 1 3 1 5 1 3 1 3 C N C C A A A A 1 3 • Marcado isotopico (continuado) • 10 a 1 que uno de estos requerimientos falla en la vida real. • Problemas de sobreexpresion, purificacion, y precipitacion • tienen arreglo. Conseguir el gen es mas complicado… • Habiendo resuelto todos estos problemas, hacemos crecer • al vector con el plasmido en medio enriquecido isotopicamen- • te. Generalmente, medio M9 (minimo), que solo tiene NH4Ac • y glucosa como fuentes de N y C. No podemos usar extrac- • tos de levadura, etc., etc. • Si queremos proteina marcada con 15N, usamos 15NH4Ac (es • barato). La glucosa-U-13C es mas cara, pero necesaria en al- • gunos casos cuando 15N solo no alcanza. • Asi obtenemos proteina marcada parcial o totalmente, en • que parte (15N) o todos (13C=O, 13Ca, and 15Ns) los nucleos • del esqueleto peptidico tienen actividad de RMN. • Ademas ahora tenemos constantes de acople 3J ‘nuevos’ • que nos dan informacion sobre otros diedros, H-C-C-15N y • H-N-C-13C, cada una con sus propios paramteros de Karplus. H O H O H O

9. Marcado isotopico (…) • Uno de los experimentos mas comunes en proteinas marca- • das con 15N es una correlacion heteronuclear 1H-15N. En • vez de hacer un HETCOR, que detectaria 15N (baja sensibi- • lidad), hacemos un HSQC o HMQC, que nos da la misma in- • formacion pero detecta 1H. • El experimento es barbaro, porque nos sirve para desparra- • mar señales de la proteina en base al corrimiento quimico del • 15N (que es grande): • Ideal para varias cosas. Una es medir velocidades de inter- • cambio de amidas. • Tambien es util en la identificacion de sistemas de espines: • Si no tenemos buena resolucion en el COSY/TOCSY y hay • señales solapadas, podemos usar una correlacion 1H-15N • para expandir el 2D a una tercera dimension… 7.0 8.0 1H d 185.0 165.0 “0” 15N d

10. Espectroscopia RMN 3D • …lo que nos trae a la espectroscopia 3D. Nada de que asus- • tarse. Los principios de la espectroscopia 3D son los mismos • que los de la 2D. • Lo podemos pensar de esta manera: De la misma forma que • el tiempo de evolucion t1 nos da la segunda dimension f1, • podemos agregar otro tiempo de evolucion y obtener un ter- • cer eje de frecuencia luego de una TF (3D): • Para un 2D teniamos: • En un 3D tenemos: • Como en los 2D, dependiendo del tipo de mezclado que use- • mos en cada pedazo, el tipo de datos que obtenemos… Preparacion Evolucion (t1) Mezcla Adquisicion (t2) f1 f2 Preparacion Evolucion (t1) Mezcla (1) Evolucion (t2) Mezcla (2) Adquisicion (t3) f1 f2 f3

11. Espectroscopia RMN 3D (continuado) • No vamos a ir pulso por pulso detallando como funcionan, • pero si voy a describir (y escribir) algunas de las secuencias • y como las analizamos. • Las tenemos que separar en dos categorias dependiendo • del tipo de mezclado: • Espectros 3D de separacion: Tomamos el sistema de • espines y separamos distintos parametros (corrimientos • quimicos, acoples) en distintas dimensiones. Un ejemplo • seria una version 3D del HOMO2DJ. Eso no es tan co- • mun en proteinas/ADN. • Espectros 3D de transferencia: En estos tenemos un • proceso de transferencia, como ser acoples-J o NOE, • para pasar informacion entre las distintas dimensiones. • Son una extension de los experimentos 2D que hemos • visto, y los que se usan mas comunmente. • La manera en que los armamos es basicamente poniendo • dos experimentos 2D uno atras del otro (al menos es facil de • entender de esta manera). • Dependiendo de esto, vamos a tener cosas como TOCSY- • HSQC, NOESY-HSQC, COSY-COSY, COSY-NOESY, • TOCSY-NOESY, etc., etc. • Vamos a ver cual es la idea con un ejemplo simple, y des- • pues como funcionan algunos de los mas comunes.

12. Espectroscopia RMN 3D (…) • Digamos que podemos exitar selectivamente solo a ciertos • protones NH de la muestra (hoy vamos a ver un poco mas • sobre pulso selectivos). Solo los protones acoplados con es- • tos protones nos darian cross-peaks: • Osea, hacemos esta exitacion selectiva seguida por un ex- • perimento TOCSY 2D. Nuestro 2D solo va a tener una franja • que corresponde a la amida que elejimos. Para una Leu: • Si cambiamos gradualmente la frecuencia del puso selectivo • a la de otro NH veriamos el TOCSY de otros aminoacido… 90 90 90s t1 tm NH Ha Hb Hg Hd

13. Espectroscopia RMN 3D (…) • Ahora podriamos poner todos los espectros 2D apilados y • cada plano tendria uncamente las conectividades de un • sistema de espines aislado: • Esto seria un ‘seudo’ experimento 3D. El problema es como • hicimos la seleccion de los NH. En general, aislamos los NHs • (o lo que queramos) con un experimento 2D que los resuelva. • Por lo que hemos visto, una correlacion 1H-15N es ideal para • esto, porque la mayoria de los cross-peaks estan bien resu- • eltos en la dimension de 15N. • Es mas, la forma en que adquirimos un 3D no involucra to- • mar un monton de 2Ds y ‘apilarlos’ para obtener el 3D, sino • que obtener datos en t1, t2, t3 y hacer una TF 3D… Frecuencias de NHs resueltas Frecuencias de 1H alifaticas

14. 1H d 1H d 15N d • Espectroscopia RMN 3D (…) • Es mas, cross-peaks que aparecen en el cubo son debidos a • transferencia de polarizacion entre los nucleos que tenemos • en las 3 dimensiones. • Un 3D que combine a una correlacion 15N-1H y a un TOCSY • tendria esta apariencia (hacer el dibujito me costo un triunfo): • Con suerte, tenemos cada una de las lineas de cross-peaks • separadas unas de otras, empezando cada una en la correla- • cion 15N-1H. Los ds de 1H estan separados por los ds de 15N. • Mirar este cubo es dificil con 200 amidas. En general solo • miramos planos a distintas frecuencias de 15N.

15. Espectroscopia RMN 3D (…) • Dependiendo de la franja (plano) que consideremos, vamos • a tener espectros TOCSY correspondientes a distintos NHs:

16. Secuencia de pulsos TOCSY-HSQC • El experimento que usamos en este ejemplo es uno de los • mas usados cuando hacemos espectroscopia 3D. La secuen- • cia de pulsos es esta: • En breve, el primer pedazo es un TOCSY en 1H, donde tene- • mos que saturar 13C o 15N (porque lo hacemos en proteina • marcada). Aca tenemos t1 (f1), osea que tenemos un TOCSY • 1H-1H en esta dimension. • La segunda parte es un HETCOR detectado inversamente • (un HSQC), donde vamos a tener frecuencias de 1H en un • eje (f1) y de 13C or 15N en el otro (f2). • Al final, como la deteccion en el periodo t3 es en 1H, tenemos • corrimientos quimicos y acoples espin-espin de 1H en f3. 90 90 {X} t2 {X} D D 13C : 15N 90 90 90 180 t1 DIPSI t3 1H:

17. Combinacion NOESY-HSQC • De manera similar se puede combinar un NOESY con el • HSQC. La secuencia es esta: • Ahora, en vez de un TOCSY en la primera parte tenemos un • NOESY. La segunda parte es identica al anterior. • En el 3D vamos a tener una correlacion 1H-15N (o 13C) en el • plano f1-f2, y espectros NOESY en los planos f1-f3. Cada uno • de estos espectros NOESY tendran unos pocos protons. Si la • resolution es buena, cada NH tendra su prop plano f1-f3. • De forma similar podemos combinar cualquier tipo de espec- • tro 2D para obtener un experimento 3D. Estos dos son los • mas usados en proteinas, que son las macromoleculas para • las cuales se hace mas RMN 3D… 90 90 {X} t2 {X} D D 13C : 15N 90 90 90 180 t1 tm t3 1H:

18. Espectroscopia RMN 3D (…) • Con datos reales: • Este NOESY-HSQC es de un mutante dimerico de GpA • (tomado de http://bioc.rice.edu/~mev/spectra3.html) 3D Proyeccion

19. Pulsos selectivos • Muchas de estas secuencias 3D se usan para determinar • sistemas de espin al principio del proceso de asignacion. La • mayoria hacen uso de algun tipo de exitacion selectiva que • actua solo en parte de los espines del peptido: • Por ejemplo, puede ser que solo queramos ver que esta en- • lazado a Has pero no a NHs. Es mas, luego de marcar la • proteina con 15N y 13C tenemos que poder controlar la trans- • ferencia de polarizacion dentro del esqueleto peptidico. • Para hacer todo esto necesitamos pulsos selectivos, los cua- • les hemos mencionado antes pero nunca descrito en detalle. • Un puslo no selectivo es corto y rectangular, lo que le da un • ancho de banda amplio centrado en la portadora (esto ya lo • vimos en detalle…). Para mejorar la selectividad podemos • hacer el tiempo de pulso mucho mas largo, lo que nos da un • rango de frecuencias mas estrecho: • Tiempo: • Frecuencia: wo wo

20. Pulsos selectivos (…) • El problema de usar pulsos selectivos rectangulares son las • bandas laterales (hay que acordarse de la TF del pulso rec- • tangular). Por lo tanto, tendriamos exitacion de frecuencias • no deseadas. • Lo que neceitamos es un pulso en el dominio de los tiempos • que afecte exclusivamente ciertas frecuencias. Osea, el pul- • so no puede tener un perfil de intensidad contra tiempo rec- • tangular, y debe tener forma (i.e., intensidad modulada). • Un metodo aproximado para determinar cual seria la forma • de un pulso es ver como queremos que sea la exitacion en el • dominio de frecuencias y hacer una TF inversa (TF-1) para • obtener la forma necesaria en el dominio del tiempo : • Para hacerlo bien se debe hacer un analisis completo de las • ecuaciones de Bloch. Las formas de pulso mas comunes son • la gausiana y la gausiana al cuadrado. Cambiando ya sea • la forma, la potencia, o largo del pulso podemos seleccionar, • por ejemplo, a los Ha, NH, 13Ca, o 13C=O de la muestra… Dw TF-1 Dt t w

21. Experimentos 3D con pulsos selectivos • …lo que nos trae de vuelta al uso de pulsos selectivos en es- • pestroscopia 3D. Ahora podemos ajustar aun mas lo que • queremos ver con nuestro 3D. En vez de, por ejemplo, exitar • todos los nucleos 13C en la molecula, podemos exitar solo los • 13Ca del esqueleto peptidico. De esta forma solo tenemos • transferencia de polarizacion que involucre a estos carbonos. • Esto es muy util porque nos permite seguir atomos a lo largo • del esqueleto peptidico de manera selectiva. Estos experi- • mentos se nombran de acuerdo a como se transfiere la pola- • rizacion de un nucleo a otro. Por ejemplo, el ‘HNCA’:

22. Experimentos 3D con pulsos selectivos (…) • Aca estamos transfiriendo polarizacion de 1H a 15N (estamos • mejorando la señal de 15N y a su vez obteniendo una correla- • cion entre los dos nucleos), despues pasandola solo a los • nucleos 13Ca (usamos pulsos p / 2 y p selectivos). • Osea, terminamos teniendo transferencia de polarizacion • de los 1Hs a los 13Ca a travez de 15N, y por lo tanto los 13Ca • quedan marcados con informacion de s de 1H y 15N. • Al final obtenemos un correlacion (cross-peak) a la frecuen- • cia de 15N-1H-13Ca (una pelota en el espacio a estas coorde- • nadas. Usando otros pulsos selectivos podemos ver otras • correlaciones. Por ejemplo, el HCA(CO)N ‘salta’ los 13C=O: