Métodos de alinhamento de sequências biológicas mcarazzo@lge.ibi.unicamp.br

1. Métodos de alinhamento de sequências biológicas mcarazzo@lge.ibi.unicamp.br Marcelo Falsarella Carazzolle Laboratório de Genômica e Proteômica Unicamp

2. Resumo • Introdução • Alinhamento • Global • Local (Smith-Waterman) • Semi global • Matrizes : BLOSUM, PAM • BLAST • BLAST via web (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) • BLAST local • PHI-BLAST, PSI-BLAST, MEGABLAST e BLAST2SEQS

3. Introdução ? • Uma forma rápida de agregar alguma informação sobre uma sequência desconhecida é compará-la com um banco de dados de sequências com funções conhecidas • Esta comparação é feita através de alinhamentos par a par entre as sequências. Isto é, se o banco de dados possuir 1000 sequências conhecidas serão realizados 1000 alinhamentos

4. - Tipicamente são usados os bancos de dados mundiais (NCBI, EMBL) Fonte: http://www3.ebi.ac.uk/Services/DBStats/ - Atualmente uma busca nesses bancos faz 100,000,000 de alinhamentos

5. - Existem vários programas de alinhamentos com diferentes metodologias, sendo que o mais utilizado é o BLAST

6. Relevância biológica • Para o biólogo é essencial que esses alinhamentos indiquem uma real similaridade entre as sequências (estatisticamente significantes) • Similaridade x Homologia • identidade = número que indica a quantidade de nucleotídeos alinhados • similaridade = considera a probabilidade do alinhamento ter ocorrido por acaso (e-value). Considera todos os outros possíveis alinhamentos • homologia = dividem a mesma ancestralidade com significado evolutivo

8. Outras aplicações • Reconstrução da sequência consensu a partir de sobreposições de fragmentos de sequências (montagens de sequências de DNA) • Alinhamento entre sequências de ESTs e DNA genômico • Comparação entre proteínas e DNA • Construção de mapas físicos • Comparação entre genomas • ...

9. Alinhamentos • A comparação entre sequências de DNA de organismos diferentes é baseada no conceito de que estes organismos originaram-se de um ancestral comum. • No contexto de evolução as sequências de DNA sofrem mutações. Estas modificações locais entre os nucleotídeos podem ser : • Inserções : inserção de uma base ou várias bases na sequência • Deleções : deleção de uma base ou mais bases na sequência • Substituições : substituição de uma base por outra • Portanto um programa de alinhamento de sequências biológicas tem que considerar essas mutações

10. Gap = -2 Match = 1 Mismatch = -1 Exemplo : • Gaps representam as inserções e deleções entre as sequências • O melhor alinhamento entre duas sequências é aquele que maximiza o score : • Score = #Matchs * (1) + #Mismatch * (-1) + #Gaps * (-2) • = 24 – 4 – 10 = 10

11. Modelos para alinhamentos • Alinhamento global • útil quando as duas sequências tem tamanhos próximos • Exemplo de programa : CLUSTAL • Alinhamento local • útil para alinhamento entre sequências de tamanhos diferentes e também para sequências com apenas alguns trechos conservados • Exemplo de programa : BLAST E FASTA • Alinhamento semi-global (ou pontas livres) • útil para encontrar sobreposições de fragmentos de sequenciamento • Exemplo de programa : PHRAP E CAP3

12. Programação dinâmica • - Motivação : gerar e testar o score de todos os possíveis alinhamentos • é exponencial no tamanho das seqüências (nn ), onde n é o tamanho das sequências : • - Se o alinhamento de 2 sequências de 100 pb leva 1 segundo, o alinhamento de um genoma de 1000 bp levaria trilhões de anos. • Abordagem alternativa : programação dinâmica. Com programação dinâmica o tempo de processamento e memória ficam quadráticos (n2): • Se o alinhamento de 2 sequências de 100 pb leva 1 segundo, o alinhamento de sequências de 1000 pb leva 100 segundos • Mas ainda não está bom, pois alinhamento de sequências de 10 Mpb (genoma de Saccharomyces) levaria 377 anos

13. Alinhamento global - Alinhamento de GACATTG com GATCAATG 1a linha e 1a coluna de M são fáceis de computar: -G A C A T T G - 0 -2 -4 -6 -8 -10 -12 -14 G -2 A -4 T -6 C -8 A -10 A -12 T -14 G -16 GA - - G - Lembre-se, penalidade de 1 gap = -2 e de dois gaps = -4 http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/stretcher-simple.html

14. - G A C A T T G - 0 -2 -4 -6 -8 -10 -12 -14 G -2 A -4 T -6 C -8 A -10 A -12 T -14 G -16 [i,j]=p(i,j) • Para um elemento da matriz [i,j] qualquer, temos p(i,j) = 1 se for um match e p(i,j) = -1 se for um mismatch.

15. -G A C A T T G - 0 -2 -4 -6 -8 -10 -12 -14 G -2 A -4 T -6 C -8 A -10 A -12 T -14 G -16 [i-1,j-1] [i-1,j] [i,j-1] [i,j] = max([i-1,j] - 2, [i-1,j-1] + p(i,j), [i,j-1] - 2) - O valor de [i,j] é definido exclusivamente pelos elementos [i-1,j-1] (diagonal), [i,j-1] (esquerda) e [i-1,j] (acima).

16. A G C 0 -4 -6 -2 A -2 1 -1 -3 A -4 -1 0 -2 A -6 -3 -2 -1 C -8 -4 -1 -5 - Construindo o alinhamento No alinhamento global o alinhamento deve ser construído a partir do extremo da matriz

17. Alinhamento local (Smith-Waterman) http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/water.html -G A C A T T G - 0 0 0 0 0 0 0 0 G 0 A 0 T 0 C 0 A 0 A 0 T 0 G 0 [i-1,j-1] [i-1,j] [i,j-1] [i,j] = max([i-1,j] - 2, [i-1,j-1] + p(i,j), [i,j-1] – 2, 0 zero) - No alinhamento local a primeira linha e coluna são inicializadas com zeros e os valores [i,j] da matriz inteira nunca ficam menores que zero

18. No alinhamento local o alinhamento deve ser construído partir do maior score da matriz e para quando encontrar um score=0

19. Alinhamento semi-global - Não penaliza espaços nas extremidades do alinhamento. • Exemplo CAGCA –CTTGGATTCTCGC | | | | | | - - - CAGCGTGG - - - - - - - - - No global teríamos, CAGCA – CTTGGATTCTCGC CAGC --- - -- G- T- - -- - - - Qual dos dois alinhamentos é mais interessante ?

20. - No alinhamento semi-global a primeira linha e coluna são inicializadas com zeros. O resto é igual ao alinhamento global

21. A abordagem de programação dinâmica é importante pois garante o melhor alinhamento entre duas seguências, mas ainda temos um problema : • Lembram-se disso : se o alinhamento de 2 sequências de 100 pb leva 1 segundo, o alinhamento de sequências de 10 Mpb (genoma de Saccharomyces) leva 377 anos • A abordagem alternativa é conhecida como o método de k-tuplas, no qual não é garantido encontrar o alinhamento ótimo (heurística) mas é significantemente mais rápido. Com esse método os conceitos de alinhamento discutidos acima foram modificados dando origem aos programas de alinhamento local : • - BLAST (Basic Local Align Sequence Tool) : Nucleic Acid Research 25 (1990), 3389 • FASTA : PNAS 85 (1988), 2444-2448 • Basicamente este método identifica uma série de palavras curtas em uma das sequências (word size) e depois realiza uma busca exata por essas palavras nas sequências a serem comparadas, filtrando assim os possíveis candidatos.

22. Alinhando proteínas • Alinhamento proteína-proteína • Alinhamento nucleotídeo-proteína • Alinhamento proteína-nucleotídeo • Alinhamento nucleotídeo-nucleotídeo (feito em proteínas)

23. Matrizes de substituição - BLOSUM (BLOcks of amino acid SUbstitution Matrix ) • - I e V => Hidrofóbicos • D e W => D (carga negativa) e W (aromático) • C => pontes de sulfeto (estrutural)

24. - A matriz foi construída a partir de alinhamentos múltiplos globais de 504 grupos de proteínas • BLOSUM 62 : grupos com similaridade >62% • BLOSUM 80 : grupos com similaridade >80% • BLOSUM 45 : grupos com similaridade >45% PNAS 89 (1992), 10915-19919

25. BLAST • Basic Local Alignment Search Tool • Algoritmo BLAST (Alstchul et al.; 1990 – J. Biol., 215, 403-410) • Implementações: NCBI BLAST e WU-BLAST • Acesso via web / local (linux) • Consulta de seqüências em BDs biológicos (nt ou proteínas) • Alinhamento – sobreposição de trechos semelhante de duas seqüências (seqs). BLAST traz pontuação e mostra alinhamentos. • Similaridade – grau de semelhança de seqs num alinhamento. • Homologia – genes com ancestral comum

26. BDs – nucleotídeos, proteínas, domínios, genomas específicos, dados particulares • Blastp – prot / prot (distantes) • Blastn – nt / nt (próximos) • Blastx – nt trad / prot (novas seqs) • Tblastn – prot / nt trad (regiões não anotadas) • Tblastx – nt trad / nt trad

27. Query = formato da seq de entrada. BD = formato das seqs do BD. nt (trad) = seq em nt traduzida pelo programa. Compara = o que é comparado, nucleotídeos (nt) ou aminoácidos (aa). Programa = um dos cinco principais tipos de blast.

28. Escolher BD BLAST – resultado http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/

29. ERRO!! Domínio encontrado ID facilita busca

31. Link Corte 1e-5

32. 1 64 query subject 71 1 134

33. BLAST – exemplos >nucleotídeo 1 GTACAAAAAAGTTGGATTTAACTTTAATAGCTATATTAGTCAGTAATGTTATTGTTTGAT GAAGGATTTTTTTATTAATAACTATTATTTTTATTTTGTTAAATAAAGGAAATAAGAGTT ATAGAGGAATTTTTAATTATTTTGTTATTCAAGAAACTCTAGGATTGTTGTTTTTATTTT TTTCTAGTAATTATATTCAGTTTATTATTTTAATAATGAAGATTGGAGTACCACCATTTC ACTTTTGGGTTTTTAGTGTTACTAATAGTATTTTTAATTATGGGTTAGTGTGGTTTTTAA CTATACAGATGTTACCTTTACTGGTAGTTTTATTACAGTTATTTGCTTCTGATATAGTGT ATTTATTTCTTTTTGGTTTGTTTAGTTGTTATCAAGAGATGTTTATGCTGAAGGTATACA GTACTTTATTAGTTGTATCATCAACTGAGTCTTTTAATTGA >proteína 1 MSLKDFFERIEPDFEKGGKYEKFYALFEAAYTIFYTPGKVNKGKTHVRDNLDLKRMMITVWACAFPAMFV GMYNVGLQAQLALVAGFATPDVWQVSLFSMFGTELTANSGWPALMWYGACFFLPIYAVTFAVGGIWEVLF ASIRGHEVNEGFFVTSILFALTLPATIPLWMVALGITFGVVVAKEVFGGTGRNFLNPALAGRAFLFFAYP LNMSGDTSWVVADGYSGATALSQAAAGTLDYAINQNWWDSFFGFIPGSVGEVSTLAILLGGLVIIYTRIA SWRIVGGVMVGMIAISTLLNVVGSDTNPMFAMPWYWHLVLGGFAFGMMFMATDPVSASFTNQAKWAYGIL IGAMAVFIRVINPAFPEGMMLAILFANLFAPLFDHFVVQANIKRRIARG http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/

34. BLAST local • Pode ser instalado localmente (Linux) • BDs e atualizações • Facilidades • Velocidade de buscas • Maleabilidade • Automatização • Dados locais • Independe de internet

35. Download • ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast • Preparação do banco de dados • formatdb –i <arquivo fasta db> -p T/F : • <arquivo fasta db> é o arquivo que contêm todas as sequências em nucleotídeo ou proteína que formarão o banco de dados do blast • -p T para arquivo fasta de proteínas e –p F para nucleotídeos • Comparação via blast • blastall –i <arquivo fasta> -p blastn/blastx/blastp/tblastx/tblastx –d <arquivo fasta db> -o <arquivo de saída> -e 1e-5 • -i arquivo fasta a ser comparado com o banco <arquivo fasta db> • -p tipo de comparação a ser realizada • -d banco de dados utilizado na comparação • -o arquivo de saída • -e evalue de corte

36. END