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Pruebas microbiológicas rápidas de los alimentos

Pruebas microbiológicas rápidas de los alimentos. Dra. Keiko Shirai. Métodos Tradicionales (cuenta en placa, NMP) simple económico aceptado Métodos Rápidos rápidos sensibles. Técnicas de cultivo.

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Pruebas microbiológicas rápidas de los alimentos

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Presentation Transcript

  1. Pruebas microbiológicas rápidas de los alimentos Dra. Keiko Shirai

  2. Métodos Tradicionales (cuenta en placa, NMP) • simple • económico • aceptado • Métodos Rápidos • rápidos • sensibles

  3. Técnicas de cultivo • Los m.o. generalmente se encuentran como poblaciones mixtas y deben ser aisladas como cultivos puros. • Un cultivo puro consiste de una población de células que provienen de una sola célula • Técnica de estría en placa • Transferencia aséptica de un cultivo Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

  4. Técnica de estría en placa • Un cultivo mixto es depositado en un área de una caja petri con agar, con un asa de siembra estéril se estría el agar varias veces. El asa de siembra puede ser esterilizada antes de estriar nuevamente el agar. Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

  5. Cuando la técnica de estría en placa ha sido llevada acabo adecuadamente, las células bacterianas se multiplicarán y crecerán en distintas poblaciones o colonias. • Las colonias formadas por diferentes bacterias tienen diversas formas, tamaño y pigmentación. • Esas diferencias pueden ayudar en la obtención de cultivos puros Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

  6. Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

  7. Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

  8. Transferencia aséptica de un cultivo • Este término es utilizado para describir el procedimiento de transferencia de m.o. de un medio de cultivo a otro, de tal forma que se elimine la contaminación por m.o. indeseables. • Es importante trabajar rápido y mantener los tubos en un ángulo que impida la entrada de contaminantes con el aire Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

  9. Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

  10. Pueden ser utilizadas para la obtención de cultivos puros Vertido Superficie Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

  11. Tinción • Simple • Consiste en el uso de un solo colorante que aumenta el contraste del espécimen contra un fondo. • Diferencial • Utilización de dos colorantes • (el colorante primario tiñe la estructura y el secundario ayuda al contraste). • Especial • Los colorantes tienen afinidad específica por estructuras celulares Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

  12. Células incoloras difíciles de ver Reactivos Tiempo Reacciones Frotis Cristal Violeta 1 minuto Colorante básico que se une a enjuagar los grupos cargados negativamente con agua de la pared celular, membrana, citoplasma. Yodo-Yoduro 1 minuto Yodo fija el cristal violeta a los grupos enjuagar negativos Alcohol-Acetona 10 a 15 Decolorar el cristal violeta y yodo de segundos las células. El color difunde de los enjuagar m.o. gram positivos más lentamente que con agua negativos, por la composición química y grosor de la pared celular de gram positivos Safranina 1 minuto Colorante básico que se liga a los grupos enjuagar negativos en ambos tipos de células. Unos cuantos grupos negativos están libres del cristal violeta en gram +, mientras que la mayoría de los grupos - están libres en bacterias gram -. En consecuencia gram+ permaneces violetas mientras que gram -, rojos o rosas Gram+ y -se tiñen azules Gram+ y - se mantienen azules Gram + permanecen azules, gram - se decoloran y son difíciles de ver Gram + las células permanecen violetas, mientrás gram - son teñidas a rosa o rojo.

  13. Métodos rápidos • Directos • Biofotometría • Conteo por microscopía electrónica • Marcaje por fluorescencia • Análisis de imágenes • Indirectos • ATP por luminiscencia • Reducción de colorantes • Cromatografía de gases • Presencia de enzimas especificas • Componentes celulares ("fingerprinting")

  14. Microscopía por fluorescencia • Los microorganismos se concentración por filtración • Se tiñen con un fluoroforo • Se detectan en el microscopio con lámpara de mercurio para inducir la excitación del fluoroforo. • Se realiza análisis de imágenes • Es rápido (ca 2 horas) • Puede ser utilizado para identificación

  15. Esporas germinadas Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

  16. Bioluminiscencia (ATP) • El ATP microbiano se hace reaccionar con la luciferasa • Se realiza un análisis luminométrico • El método es rápido (de 30 min a 2 horas) • Se puede determinar viabilidad.

  17. La ATP-Bioluminiscencia está basada en una reacción que ocurre en forma natural en las luciérnagas (Photinus pyralis). La reacción bioluminiscente catalizada por la luciferasa utiliza la energía química contenida en la molécula de ATP para producir la descarboxilización oxidativa de la luciferina a oxiluciferina, dando como resultado la producción de LUZ. La cantidad de luz emitida es proporcional a los niveles de microorganismos y/o materia orgánica presente.

  18. Análisis de imágenes • A. niger

  19. S0 S2 S6 P1 S1 S5 P2 S3 S4 S10 P3 S9 S7 S8 P4 P5 P6 GEOMETRICMODEL The number of segments is a function of the number of tips. NS = 2Nt – 1 11 = 2(6) – 1 Biomass is a function of the number of tips: X = NS[rpd2Lav/4] NS= 2nt+1 - 1 t = 0; NS = 1 dNS/dt = nln(2)2nt+1

  20. HYPHAL GROWTH KINETICS X = [2*2nt-1][rpd2Lav/4] dX/dt = n2ln(2)2nt[rpd2Lav/4] (1/X)dX/dt = n2ln(2)2nt/[2*2nt-1]; For 2nt>>1; (1/X)dX/dt nln(2)  µ X = Xoeµt;Find t = 1/n

  21. HYPHAL LENGTH vs TIME • Glucosa: (g/L) • g 10; • n 40; • Ñ 70; • 120; • u 300 dL/dt = UrL/(KL + L) (empirical rate law)

  22. FINDING BRANCHING TIME t dL/dt = UrL/(KL + L) (empirical law) Ur = maximal rate of hyphal extension (cm/h) KL = empirical constant of saturation (cm) After integration, between L0 and LC, the branching time, t, is estimated as follows, t = [1/ Ur][KLln(LC/ L0) +LC - L0] = hours

  23. APPROXIMATE MODELS • For LC << KL  KLln(LC/ L0) +LC - L0  KLln(LC/ L0) t [1/ Ur][KLln(LC/ L0)] Early branching mechanism (Larralde model) • For LC >> KL>L0 KLln(LC/ L0) +LC - L0  LC t [1/ Ur][LC] Late branching mechanism (Trinci model)

  24. MICROSCOPIC MODELS Larralde-Corona et al., (1993); Lc << KL • µ = ln(2)UR/[KLln(Lav/d0)]

  25. PCR • Extracción de ADN, este se amplifica en PCR • Nucleótidos específicos son concentrados y reaccionan con reactivos fluorescentes para cuantificar • Resultados son obtenidos en 1 a 3 horas • Sensible.

  26. Cromatografía de gases • Se determinan ácidos grasos. • No es un método rápido • No es sensible

  27. Kits Bioquímicos comerciales para la detección e identificación de patógenos

  28. Componentes celulares (Molecular fingerprinting) Es una estrategia analítica para identificar metabolitos en una ruta ó para una clase de compuestos. Los resultados obtenidos pueden ser interpretados en términos de rutas metabólicas conocidas e interacciones fisiológicas.

  29. Componentes celulares (Metabolic fingerprinting) X extraction Y Spectroscopy: Usually by direct injection without any chromatography step PCA: Principle Components analysis DFA: Discrimination Functional analysis

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