Aleksander L. Sieroń

1. KATEDRA I ZAKŁAD BIOLOGII OGÓLNEJ MOLEKULARNEJ I GENETYKI, SUM.KATOWICE-LIGOTAUL. MEDYKÓW 18, BUD. C-1, WITRYNAhttp://biolmolgen.slam.katowice.pl Aleksander L. Sieroń

2. Aleksander L. SIEROŃ Mutacje i mechanizmy ich powstawania i naprawy DNA KATEDRA I ZAKŁAD BIOLOGII OGÓLNEJ, MOLEKULARNEJ I GENETYKI ŚLĄSKI UNIWERSYTET MEDYCZNY *KATOWICE*

3. MUTAGEN • MUTAGEN to substancja lub czynnik, który powoduje wzrost częstości zmian w genach. • Te mutacje mogą być następnie przekazywane komórkom potomnym, a czasami mogą również prowadzić do powstawania komórek nieprawidłowych lub nowotworowych. • Klasy MUTAGENÓW obejmują ale nie są ograniczone do: • czynników biologicznych • czynników chemicznych • fizycznych • wystawienie na działanie światła ultrafioletowego • wystawienie na działanie promieniowania jonizującego.

4. Jest wiele rodzajów mutacji, • niektóre z nich są „obojętne”, • a inne mogą mieć istotny wpływ na działanie organizmu.

5. Mutageny można wykrywać np.: Testem Ames’a lub innymi metodami biochemicznymi. Test Ames’ajest sposobem oznaczania czy badany czynnik posiada zdolność wywoływania mutacji genetycznych. W tym celu wyciąg komórek wątroby zwierzęcej miesza się ze specjalnym szczepem bakterii Salmonella. Mieszanina jest następnie poddawana działaniu badanej substancji lub badanego czynnika. Po zakończeniu ekspozycji wykrywa się występowanie zmutowanych bakterii (powstanie mutacji pod wpływem badanego czynnika nazywa się MUTAGENEZĄ). Test Ames’a nie wskazuje bezpośrednio, czy badany czynnik posiada właściwości kancerogenne (wywołuje nowotwory). Zazwyczaj istnieje jednak, w badaniach na modelach zwierzęcych, związek między potencjałem mutagennym czynnika i jego potencjałem kancerogennym.

6. UWAGA!!! NIE MYLIĆ MUTAGENU Z KANCEROGENEM (CZYNNIKIEM WYWOŁUJĄCYM RAKA) MUTAGENY MOGĄ, ALE NIE MUSZĄ WYWOŁYWAĆ RAKA !!! Kancerogenem jest substancja, która powoduje raka (lub jest podejrzana o to, że powoduje raka). Czynnikiem kancerogenny jest czynnik, który podejrzewa się o powodowanie raka. Proces tworzenia komórek raka z normalnych komórek to KANCEROGENEZA.

7. UWAGA!!! NIE MYLIĆ MUTAGENU Z TERATOGENEM (CZYNNIKIEM POWODUJĄCYM ZMIANĘ LUB SZKODĘ W ROZWIJAJĄCYM SIĘ PŁODZIE LUB ZARODKU) Teratogen to czynnik, który może powodować wady w zarodku lub u płodu. Może to być substancja chemiczna, wirus lub promieniowanie jonizujące. Teratogen jest bliski toksynom płodowym, wywołującym objawy toksyczne w rozwijającym się płodzie. Zarówno toksyny płodowe, jak i teratogeny są toksynami rozrodczymi czyli czynnikami, powodującymi uszkodzenie w układzie rozrodczym i/lub wewnątrz-wydzielniczym matki i/lub rozwijającym się płodzie.

8. TYPY MUTACJI • MUTACJA TO: • Dziedziczna zmiana w sekwencji zasad DNA wynikająca z działania mutagenów. Różne typy mutacji obejmują przesunięcie ramki odczytu, zmianę sensu kodu, i kod nonsensowny.

9. TYPY MUTACJI • CHROMOSOMOWE • LICZBOWE – dotyczą braku (monosomia) lub nadmiaru (trisomia) pojedynczych chromosomów (aneupolidia), lub zwielokrotnienia całego haploidalnego garnituru chromosomów (poliploidia) • STRUKTURALNE - dotyczą bardzo długich odcinków DNA (milionów par zasad), które powodują zaburzenia funkcji pojedynczego genu lub częściej wielu genów)

10. TYPY MUTACJI • CHROMOSOMOWE • STRUKTURALNE - dotyczą bardzo długich odcinków DNA (milionów par zasad), które powodują zaburzenia funkcji pojedynczego genu lub częściej wielu genów) • Najczęściej odnoszą się one do mutacji dotyczących całych chromosomów, takich jak inwersja części jednego chromosomu powodująca, że odwrócona część nie ma już odpowiednika w parze homologicznej. Translokacje części chromosomu do innego chromosomu, po delecji części chromosomów, lub wypadkach, które zdarzają się podczas podziału jądra komórkowego, takich jak nierówny rozdział chromosomów do komórek potomnych.

11. TYPY MUTACJI • II. PUNKTOWE • To zmiana w kodowanym przez zmutowany gen produkcie spowodowana przez: • zamianę pojedynczej zasady substytucja (na ten sam rodzaj zasady azotowej – tranzycja, na inny rodzaj zasady azotowej – transwersja), • dodanie jednej lub większej liczby zasad - insercja • ubytek jednej lub większej liczby zasad – delelecja • odwrócenie odcinka DNA - inwersja

12. MUTACJE PUNKTOWE • DOTYCZĄ KONDONÓW

13. MUTACJE KODONÓW • 1. KODON JEST • podstawową jednostką kodu genetycznego, zbudowanym • z trójnukleotydowych sekwencji w rybonukleinowym • kwasie informacyjnym (mRNA). Każdy kodon • podlega translacji do jednego aminokwasu w • syntetyzowanym białku. • 2. KODON POCZĄTKOWY - INICJUJĄCY • Sekwencja, która koduje pierwszy aminokwas w • sekwencji polipetydu. Jest nim zwykle kodon AUG u • eukariota i czasem GUG u prokariota. • 3. KODON NONSENS • sygnalizuje koniec łańcucha polipeptydowego. • Nie koduje on żadnych aminokwasów.

14. MUTACJE KODONÓW • TERMINUJĄCY (stop kodon) • Są to kodony UAA, UAG i UGA, sygnalizujące koniec • syntezy łańcucha polipeptydowego. • KODON AMBER • Nonsensowy kodon UAG, jeden z trzech kodonów które • zamiast aminokwasów sygnalizują zakończenie • translacji mRNA do łańcucha aminokwasowego. • ANTYKODON • Specyficzna sekwencja trzech nukleotydów w • transportującym RNA, komplementarna do kodonu • specyficznego aminokwasu w informacyjnym RNA.

15. Skutki mutacji punktowych • Substytucji • zmiana sensu kodu – kodon po zmianie koduje inny aminokwas niż przed zmianą • mutacja milcząca – nowy kodon koduje taki sam aminokwas • nonsens/STOP powstaje kodon nie kodujący żadnego aminokwasu. Prowadzi do przedwczesnego zakończenia translacji np.: KODON AMBER - UAG. • zaburzenie składania mRNA ze skutkiem pomijania egzonów, jeżeli nastąpiła w sekwencji intronu rozpoznawanie przez kompleks wycinający.

16. Skutki mutacji punktowych • B. Insercji • przesunięcie fazy (ramki) odczytu), co prowadzi do zmiany kodonów i/lub powstanie kodonu nonsens. • wstawienie jednego lub więcej aminokwasów, gdy nastąpiła insercja jednego lub więcej kodonów. Wynikiem jest nowy, dłuższy produkt o innych właściwościach niż produkt oryginalny

17. Skutki mutacji punktowych • C. Delecji • przesunięcie fazy (ramki) odczytu), co prowadzi do zmiany kodonów i/lub powstanie kodonu nonsens. • ubytek jednego lub więcej aminokwasów, gdy nastąpiła delecja jednego lub więcej kodonów. Wynikiem jest nowy, krótszy produkt o innych właściwościach niż produkt oryginalny

18. Skutki mutacji punktowych • D. Inwersji • przesunięcie fazy (ramki) odczytu), co prowadzi do zmiany kodonów i/lub powstanie kodonu nonsens. • zmiana sensu kodu od miejsca inwersji z końca 5’ i/lub powstanie kodonu nonsens • zaburzenie składania mRNA ze skutkiem pomijania egzonów, jeżeli objęła część intronu.

19. INNE TYPY MUTACJI • SPONTANICZNA • Mutacja występująca samoistnie, bez działania • mutagenu, na przykład podczas replikacji DNA. • Mutacje spontaniczne pojawiają się ze stałą • regularnością. Częstość pojawiania się mutacji • spontanicznych służy jako „zegar ewolucyjny” do • określania pokrewieństwa dwóch (lub więcej) odrębnych • gatunków.

20. INNE TYPY MUTACJI • WARUNKOWE • Mutacje, których znaczenie ujawnia się jedynie w • określonych warunkach, takich jak na przykład niska • lub podwyższona temperatura. • ZA PROMOTOREM • Mutacje (polegające na zmianie w sekwencji par zasad) • w odcinku promotora; zwykle powodują one słabszą • ekspresję genu (zachodzi słabsza transkrypcja genu).

21. INNE TYPY MUTACJI • POLARNE • Mutacja w pojedynczym genie, która zmienia tempo • ekspresji genów sąsiadujących na tym samym • chromosomie. • WSTECZ • Powoduje odwrócenie zmutowanego genu w porównaniu z rodzimą sekwencją zasad nukleotydowych. • WPRZÓD • Odwrócenie mutacji wstecz.

22. INNE TYPY MUTACJI • SUPRESOROWA • Mutacja odtwarzająca, przynajmniej w tym samym • stopniu, funkcję utraconą w wyniku mutacji pierwotnej • (mutacja supresorowa dotyczy innego miejsca niż • mutacja pierwotna). • NIESTABILNA • Mutacja, która ma duże prawdopodobieństwo powrotu • to postaci wyjściowej.

23. INNE TYPY MUTACJI • POWYŻEJ • Odnosi się do każdej mutacji w obrebie promotora • genu lub w sekwencji poprzedzającej promotor, która • może zaburzać rozpoczęcie transkrypcji.

24. Mechanizmy powstawania mutacji i naprawy DNA 1. Molekularne mechanizmy mutacji punktowych 2. Naprawa DNA: - fotoreaktywacja - naprawa przez wycinanie - naprawa przez sprawdzanie poprawności replikacji i wykrywanie nie sparowanych zasad - naprawa po replikacji - naprawa pęknięć podwójnej helisy u ssaków 3. Przyczyny aberracji chromosomowych i poliploidy

25. DNA podlega w komórkom licznym modyfikacjom chemicznym, z który większość powoduje uszkodzenia zawartej w nim informacji genetycznej (jest to fakt o którym często zapominamy w ferworze podniecenia, że możemy sekwencjonować DNA z różnych próbek, w tym wysuszonych, jak i zamrożonych). Jeżeli informacja genetyczna zakodowana w DNA ma być poprawna to wszelkie modyfikacje chemiczne muszą być na bieżąco korygowane. Niezdolność do naprawy DNA Główną przyczyną utrwalenia mutacji.

26. Czynniki uszkadzające DNA Określone długości fali promieniowania jonizującego, takie jakpromienie gamma ipromienieX Promienie ultrafioletowe, szczególnieUV-C (~260 nm)które są absorbowane silnie przez DNA, ale również o większej długości UV-B, które przenika przez warstwę ozonu. Wysoko-reaktywne rodniki tlenoweprodukowane w normalnym oddychaniu komórkowym jak również w innych szlakach biochemicznych. Związki chemiczne w środowisku. wielewęglowodorów, w tym niektóre występujące w dymie papierosowym. Niektóre produkty roślinne i mikroorganizmów, np.:aflatoksynywytwarzane w pleśni orzeszków ziemnych (fistaszków). Związki chemiczne stosowane w chemioterapii, szczególnie w chemioterapiinowotworów.

27. Rodzaje uszkodzenia DNA Wszystkie cztery rodzaje zasad w DNA (A, T, C, G) mogą być kowalencyjnie modyfikowane w różnych miejscach. Najczęściej występuje utrata grupy aminowej ("deaminacja") – prowadząca, np.: do zmiany CwU. Brak parowania normalnych zasad wynikające z błędnego odczytu podczas replikacji DNA. Częstym przykładem jest wbudowanie pyrimidineU (normalnie występującej wyłącznie RNA) zamiastT. Złamaniawszkielecie. Mogą występować w jednej z dwóch nici (złamanie jednej nici - ang. single-stranded break,SSB) lub w obydwuniciach (złamanie obydwu nici – ang. double-stranded break (DSB). Promieniowanie jonizujące jest częstą przyczyną złamań, chociaż niektóre związki chemiczne również mogą powodować pęknięcia nici. Wiązania krzyżoweKowalencyjne wiązania mogą powstawać między zasadami w tej samej nici DNA (wewnątrzniciowe - ang. "intrastrand") lub między różnymi niciami (międzyniciowe - ang. "interstrand"). Liczne leki chemoterapeutyczne stosowanie w leczeniu nowotworów mogą tworzyć wiązania krzyżowe w DNA.

28. Mechanizmy powstawania mutacji i naprawy DNA 1. Molekularne mechanizmy mutacji punktowych 2. Naprawa DNA: - fotoreaktywacja - naprawa przez wycinanie - naprawa przez sprawdzanie poprawności replikacji i wykrywanie nie sparowanych zasad - naprawa po replikacji - naprawa pęknięć podwójnej helisy u ssaków 3. Przyczyny aberracji chromosomowych i poliploidy

29. Naprawa uszkodzonych zasad • Uszkodzone lub nieprawidłowe zasady mogą być naprawiane przez kilka mechanizmów: • Bezpośrednie chemiczne odwrócenie uszkodzenia • Naprawa przez wycięcie, które usuwa uszkodzoną zasadę lub kilka zasad i zastępuje je prawidłowymi na drodze lokalnej syntezy DNA. Uznawane są trzy typy naprawy przez wycinanie, z których każdy zależy od zestawu wyspecjalizowanych enzymów. • Wycinanie zasad – ang. Base Excision Repair (BER) • Wycinanie nukleotydów – ang. Nucleotide Excision Repair (NER) • Nparawa niesparowanych zasad – ang. Mismatch Repair (MMR)

30. Naprawa uszkodzonych zasad Bezpośrednie chemiczne odwrócenie uszkodzenia Najczęstszą przyczyną mutacji punktowych u człowieka jest spontaniczne dodanie grupy (CH3-) (alkilacja) do Cytydyn i następnie deaminacjido T. Szczęśliwie większość tych zmian jest naprawiana przez enzymy zwane glikozylazami, które usuwają nie sparowane T odtwarzając prawidłową C. Ta naprawa przebiega bez konieczności przerwania ciągłości nici DNA (przeciwnie niż w mechanizma wycinania opisanych dalej). Niektóre leki stosowane w chemioterapii ("chemo") również uszkadzają DNA przezalkilację. Niektóre grupy metylowe są usuwane przez białkowy produkt genuMGMT. Jednakże, cząsteczka tego białko może katalizować tę reakcję tylko jeden raz. W związku z tym usunięcie każdej nowej grupy metylowej wymaga nowej cząsteczki białka. Ilustruje to poważny problem mechanizmów bezpośredniego odwracania uszkodzeń DNA, które cechuje rozrzutność. Każdy z niezliczonych typów chemicznych uszkodzeń zasad wymaga własnego mechanizmu naprawczego. Komórki potrzebują bardziej uniwersalnych mechanizmów zdolnych do korekcji każdego rodzaju uszkodzeń chemicznych. Wymaganiu tego rodzaju odpowiada mechanizm naprawy przez wycinanie.

31. Mechanizmy powstawania mutacji i naprawy DNA 1. Molekularne mechanizmy mutacji punktowych 2. Naprawa DNA: - fotoreaktywacja - naprawa przez wycinanie - naprawa przez sprawdzanie poprawności replikacji i wykrywanie nie sparowanych zasad - naprawa po replikacji - naprawa pęknięć podwójnej helisy u ssaków 3. Przyczyny aberracji chromosomowych i poliploidy

32. Naprawa uszkodzonych zasad Naprawa przez wycięcie zasady – ang. Base Excision Repair (BER) Etapy i kluczowi gracze: Usunięcie uszkodzonej zasady (szacunkowo występuje około 20.000 razy dziennie w naszym organizmie!) przez glikozylazę DNA. Mamy co najmniej 8 genów kodujących różne glikozylazy DNA, z których każda odpowiada za identyfikację i usunięcie specyficznego rodzaju uszkodzenia zasady. Usunięcie fosforanu deoksyrybozyw szkielecie, tworzące przerwę. Mamy dwa geny kodujące enzymy o tej funkcji. Zastąpienie prawidłowym nukleotydem. Ta funkcja zależy od beta polimerazy DNA, jednej z co najmniej 11 polimeraz DNA, których geny znajdują się w naszym genomie. Ligacja przerwanej nici. Dwa enzymy poznano dotychczas, które katalizują tę reakcję, obydwa wymagają ATP jako źródła energii.

33. Naprawa uszkodzonych zasad Naprawa przez wycięcie nukleotydu – ang. Nucleotide Excision Repair (NER) NER różni się od BER!!! Wymaga innych enzymów!!! Jeżeli nawet tylko jedna „zła” zasada jest do naprawienia, to wraz z uszkodzonym nukleotydem usuwanych jest kilka sasiednich; a zatem, NER robi dużą „dziurę” wokół uszkodzenia.

34. Naprawa uszkodzonych zasad Naprawa przez wycięcie nukleotydu – ang. Nucleotide Excision Repair (NER) Etapy i kluczowi gracze: Uszkodzenie jest rozpoznawane przez jedno lub więcej białek tworzących kompleks w miejscu uszkodzenia. DNA jest rozplatany i tworzy się "bąbel". Układ enzymów uczestniczących to czynnik transkrypcyjnyIIH, TFIIH, (który działa także w normalnej transkrypcji). Nacięcia wykonywane są po obydwu stronach 3' i 5' uszkodzeniacelem usunięcia ciągu zawierającego uszkodzenie. Zachodzi miejscowa synteza DNA de nowo – używając nieszkodzonej (komplementarnej) nici jako matrycy – wypełniając lukę prawidłowymi nukleotydami. Polimerazy DNA odpowiedzialne to polimerazy delta i epsilon. Ligaza DNA łączy kowalencyjnie nowe końce przerwanej nici.

35. Mechanizmy powstawania mutacji i naprawy DNA 1. Molekularne mechanizmy mutacji punktowych 2. Naprawa DNA: - fotoreaktywacja - naprawa przez wycinanie - naprawa przez sprawdzanie poprawności replikacji i wykrywanie nie sparowanych zasad - naprawa po replikacji - naprawa pęknięć podwójnej helisy u ssaków 3. Przyczyny aberracji chromosomowych i poliploidy

36. Naprawa uszkodzonych zasad Naprawa niesparowanych zasad, ang. Mismatch repair (MMR) MMR dotyczy korekty nukleotydów które nie spełniają zasady parowania zasad według Watsona-Cricka (A:T, C:G). Mechanizm ten wymaga udziału licznych enzymów, które uczestniczą zarówno w mechanizmie BER, jak i w NER, a także inne wyspecjalizowane enzymy. Brak parowania zasad jest rozpoznawany przez kilkanaście enzymów w tym produkty genów MSH2 i MLH1. Mutacja każdego z nich predestynuje nosiciela do dziedzicznej postaci raka jelita grubego. Geny te są więc uważane za geny supresorowe rozwoju guzów. Synteza „łatki naprawczej” jest katalizowana przez te same enzymy, które działają w mechanizmie NER, a więc polimerazy DNA delta i epsilon. Komórki wykorzystują mechanizm MMR także do kontroli przebiegu rekombinacji, na przykład upewniając się, że tylko odcinki homologiczne dwóch cząsteczek DNA parują się po crossing over i rekombinują odpowiednie segmenty. Jeżeli polimeraza II RNA, posuwająca się wzdłuż matrycy (antysens), napotka uszkodzoną zasadęmoże rekrutować inne białka, takie jak CSA i CSB i dokonywać błyskawicznej naprawy zanim zakończy transkrypcję genu.

37. Mechanizmy powstawania mutacji i naprawy DNA 1. Molekularne mechanizmy mutacji punktowych 2. Naprawa DNA: - fotoreaktywacja - naprawa przez wycinanie - naprawa przez sprawdzanie poprawności replikacji i wykrywanie nie sparowanych zasad - naprawa po replikacji - naprawa pęknięć podwójnej helisy u ssaków 3. Przyczyny aberracji chromosomowych i poliploidy

38. Naprawa pęknięć nici Promieniowanie jonizujące i niektóre związki chemiczne wywołują zarówno: Pęknięcia jednej nici (SSBs), jak iobydwu (DSBs) szkieletu DNA.

39. Naprawa pęknięć nici Pęknięcia jednej nici Single-Strand Breaks (SSBs) Są naprawiane przez te same enzymy, które uczestniczą Base-Excision Repair (BER).

40. Naprawa pęknięć nici Pęknięcia dwóch nici Double-Strand Breaks (DSBs) Dwa mechanizmy, przez które komórka naprawia pęknięcia nici DNA: 1. Bezpośrednie łączenie końców pękniętej nici. Wymaga to udziału białek, które rozpoznają i wiążą wolne końce i zbliżają je do siebie celem ligacji. Enzymy preferują komplementarne, lepkie końce, ale równie dobrze radzą sobie przy braku takowych. 2. Łączenie niehomologicznych końców (NHEJ).

41. Naprawa pęknięć nici • Pęknięcia obydwu nici Double-Strand Breaks (DSBs) • Błędy w bezpośrednim łączeniu mogą być przyczyną różnych translokacji,które wiążą się z nowotworami. • Przykłady: • Białaczka Burkitt‘a • chromosomFiladelfia wostrej białaczce szpikowej • Białaczka typu B

42. Naprawa pęknięć nici Pęknięcia obydwu nici - Double-Strand Breaks (DSBs) 2. Rekombinacja homologiczna. Końce pękniętej nici są łączone w oparciu o informację nie uszkodzonej chromatydy siostrzanej (w G2 po duplikacji chromosomów), lub na chromosomie homologicznym (w G1; tzn., zanim chromosomy uległy duplikacji). Proces wymaga poszukiwania homologu w jądrze komórkowym – przedsięwzięcie wysoce niepewne (w G1 komórki preferują naprawę DSBs przez NHEJ. Dwa białka uczestniczą w homologicznej rekombinacji, a mianowicie produkty genów BRCA-1 iBRCA-2. Dziedziczne mutacje tych genów predysponują kobiety do raka piersi i jajnika.

43. Naprawa pęknięć nici Pęknięcia obydwu nici Double-Strand Breaks (DSBs) Mejoza również charakteryzuje się powstawaniem DSBs Rekombinacja między chromosomami homologicznymi podczas mejozy cechuje się powstawaniem DSBs i koniecznością ich naprawy. Proces ten wymaga udziału takich samych enzymów jak pęknięcia nici z innych przyczyn.