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É TUDE DU POLYMORPHISME ASSOCI É AUX R É P É TITIONS EN TANDEM POUR LE TYPAGE DE BACT É RIES PATHOGÈNES: Pseudomonas ae

Université Evry Val d’Essonne. Université Paris-Sud. I. G. M. É TUDE DU POLYMORPHISME ASSOCI É AUX R É P É TITIONS EN TANDEM POUR LE TYPAGE DE BACT É RIES PATHOGÈNES: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus. Lucie Onteniente.

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É TUDE DU POLYMORPHISME ASSOCI É AUX R É P É TITIONS EN TANDEM POUR LE TYPAGE DE BACT É RIES PATHOGÈNES: Pseudomonas ae

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  1. Université EvryVal d’Essonne Université Paris-Sud I.G. M ÉTUDE DU POLYMORPHISME ASSOCIÉ AUX RÉPÉTITIONS EN TANDEM POUR LE TYPAGE DE BACTÉRIES PATHOGÈNES:Pseudomonas aeruginosa,Staphylococcus aureus Lucie Onteniente Laboratoire Génomes, Polymorphisme et MinisatellitesInstitut de Génétique et Microbiologie, UMR 8621Université Paris SudOrsay

  2. I. Introduction II. Pseudomonas aeruginosa III. Staphylococcus aureus IV. Conclusions et Perspectives

  3. I. Introduction II. Pseudomonas aeruginosa III. Staphylococcus aureus IV. Conclusions et Perspectives

  4. Pour des études épidémiologiques à l’échelle planétaire. ex: Mycobacterium tuberculosis Une des causes majeures de mortalité:3 millions de morts par an. Typage de souches de bactéries pathogènes Dans de nombreux domaines, une surveillance épidémiologique est nécessaire: 1) Préoccupations de Santé Publique:

  5. Pour effectuer un suivi des infections nosocomiales. ex: Staphylococcus aureus ex: Pseudomonas aeruginosa Typage de souches de bactéries pathogènes 1) Préoccupations de Santé Publique: P. aeruginosa et S. aureus sont responsables de 30% des infections nosocomiales en France.

  6. Dans le cas d’attaques bioterroristes, pour identifier l’origine de la souche employée. ex: Bacillus anthracis Typage de souches de bactéries pathogènes 2) Préoccupations de Défense:

  7. Facilité de mise en oeuvre Reproductibilité Pouvoir discriminant Coût Nécessité d’une surveillance épidémiologique Dans toutes ces situations, un typage au niveaude la souche est essentiel. Il est nécessaire de pouvoir collecter et comparer les données de typage de souches entre laboratoires. Passe obligatoirement par l’utilisation de techniques de typage standardisées:

  8. Principales techniques de génotypage des bactéries Ce sont les techniques basées sur l’étude du polymorphisme de l’ADN: - PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis) - RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) et Ribotypage - RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)- AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) - MLST (MultiLocus Sequence Typing)- SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) - MLVA (Multiple Locus VNTR Analysis)

  9. Évaluation de l’approche MLVA pourle typage de Pseudomonas aeruginosaet de Staphylococcus aureus. L’approche MLVA (Muliple Locus VNTR Analysis) - Les répétitions en tandem polymorphes peuvent constituer des marqueurs génétiques efficaces pour distinguer les souches. - En 2001, l’approche MLVA était validée pour deux espèces bactériennes très homogènes (d’émergence récente): B. anthracis (P.Keim)et M. tuberculosis (M.Frothingham, P.Supply).

  10. Il s’agit de successions d’un motif répété (ex: 4 x 12pb) AACTTTACGTTC AAATTAACGTTC AAATTAACGTTC AAATTTACCTTG monomorphes polymorphes Les répétitions en tandem Les répétitions en tandem sont présentes dans tous les génomes, eucaryotes comme procaryotes, dans les séquences codantes comme dans les régions non-codantes. Les répétitions en tandem sont :

  11. Les répétitions en tandem chez les bactéries - Les répétitions en tandem constituent une proportion variable des génomes bactériens,de 1 à 2% en général.

  12. Variation du nombre de motifs d’où le terme VNTR (Variable Number of Tandem Repeats). Variation de séquence interne aux motifs: les motifs peuvent contenir des mutations. Polymorphismes des répétitions en tandem Deux types de polymorphisme possibles: Approche MLVA Séquençage d’allèles

  13. Illustration de l’approche MLVA Exemple: 20 VNTRs développés chez Y. pestis(Le Flèche P, BMC Microbiol. 2001;1(1):2)

  14. Concerne souvent les petits motifs(exemple: le locus ms10 chez P. aeruginosa). Peut être observée pour des motifs plus grands, par exemple dans la famille desMIRUs chez M. tuberculosis. Variation de séquence interne aux motifs Les motifs d’une répétition en tandem sontplus ou moins conservés. Conservation parfaite des motifs:pas de polymorphisme interne

  15. Par exemple la répétition Mu50_1132 (S. aureus). Variation de séquence interne aux motifs Conservation imparfaite des motifs:

  16. http://minisatellites.u-psud.fr/ Un outil d’identification des répétitions en tandem On peut identifier les répétitions en tandem in silico : une base de données des répétitions en tandema été développée au laboratoire (F. Denoeud).

  17. Un seul génome entièrement séquencé Plusieurs génomes séquençés de même espèce bactérienne P. aeruginosa (souche PAO1) S. aureus(6 génomes séquencés) Sélection in silico de répétitions polymorphes Démarche systématique (Polymorphisme testé expérimentalement) Utilisation de la base de données de recherche de répétitions en tandem Deux situations:

  18. I. Introduction II. Pseudomonas aeruginosa III. Staphylococcus aureus IV. Conclusions et Perspectives

  19. - 14% des infections nosocomiales en France- Première cause d’infection pulmonaire des patients atteints de mucoviscidose. Caractéristiques de Pseudomonas aeruginosa • Bactérie Gram négatif, ubiquitaire: • Présente dans l’environnement (eau, sol, plantes…). Présente aussi dans l’environnement hospitalier humide (matériel de dialyse, robinets, éviers, siphons, solutions désinfectantes…). - Possède naturellement des résistances à des antibiotiques, problème des souches multi-résistantes. - Peut former des biofilms.

  20. Limites des techniques de phénotypage: Limites des techniques de génotypage: Pourquoi développer une analyse MLVA chezPseudomonas aeruginosa? - Problème de souches non sérotypables. • Manque de pouvoir discriminant du ribotypage, coût élevé. • - Lourdeur de la technique du champ pulsé, problème de comparaison de résultats inter-laboratoires.

  21. Nécessité de combiner l’analyse par ribotypage à d’autres techniques plus discriminantes. Collection de souches P. aeruginosa Évaluation de la diversité génétique par ribotypage, des souches de P. aeruginosa collectées dans des hôpitaux européens.(Brisse S, J Clin Microbiol. 2000 Oct;38(10):3636-45) 102 souches cliniques provenant de cette étude ont été sélectionnées pour évaluer l’approche MLVA. 54 ribogroupes représentés dont 2 majoritaires:87-S-3 : 27 souches (sérotype O12)88-S-2 : 18 souches (sérotype O11) Peut-on améliorer par analyse MLVA, la résolution des souches des deux ribogroupes majoritaires?

  22. Taille du motif >9pb:pour des raisons d’instabilité des répétitions à petits motifs, secondairement pour des raisons techniques. Nombre de motifs >7. 201 répétitions en tandem à tester.Choix d’une sous-collection de 12 souches. P. aeruginosa : un seul génome disponible - Le génome de P. aeruginosa est très richeen répétitions en tandem (>3000). - Choix des répétitions en tandem selon des critères peu « stringents »:

  23. 23 abandonnées 170 monomorphes 8 polymorphes: - 2 répétitions à petits motifs, très polymorphes.- 5 répétitions moyennement polymorphes.- 1 répétition éliminée de l’analyse MLVA finale: ms194 (petit motif/grands allèles). 13 souches éliminées de l’étude. 89 souches + PAO1 (46 ribogroupes)réparties en 72 génotypes MLVA. Bilan du génotypage: arbre MLVA - Sur 201 répétitions en tandem testées par PCR: - Sur 102 souches analysées:

  24. 7 répétitions en tandem pour l’analyse MLVA

  25. Génotypes Matrice des distances Soucheinconnue Reconstruction d’un arbre A B C D génotypage E F G Identification de la souche la plus proche H I J K Approche MLVA: basée sur le polymorphisme de longueur

  26. Représentation des données sous forme d’arbres

  27. 2 Arbre « minimum spanning tree » MLVA (5 locus), 40 génotypes: 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Arbre « minimum spanning tree » MLVA (7 locus), 72 génotypes: 2 7 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 37 1 1 1 1 1 1 1 1 1 6 1 20 7 3 3 3 3 3 3 3 3 3 38 32 2 2 2 2 2 2 2 2 2 35 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 21 36 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 1 19 4 39 28 33 3 3 3 3 3 3 3 3 3 6 9 31 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 2 2 2 3 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 34 23 40 3 3 3 3 3 3 2 2 2 3 3 3 2 2 2 2 2 2 25 22 4 4 4 4 4 4 4 4 4 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 28 1 1 1 1 1 1 1 1 1 40 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 33 31 17 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 2 2 2 3 3 3 2 2 2 3 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 18 3 3 3 3 3 3 4 4 4 3 3 3 4 4 4 4 4 4 38 3 3 3 3 3 3 3 3 3 22 4 4 4 9 4 4 4 37 4 4 4 2 2 2 2 2 2 2 2 2 36 3 3 3 3 3 3 3 3 3 21 10 3 3 3 3 3 3 2 2 2 3 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 26 32 2 2 2 2 2 2 2 2 2 8 26 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 24 26 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 26 3 3 3 3 3 3 3 3 3 35 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 17 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 27 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 1 1 1 1 1 26 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 4 4 1 1 1 4 4 4 4 4 4 2 26 1 1 1 1 1 1 1 1 1 26 2 2 2 2 2 2 2 2 2 27 22 2 2 2 2 2 2 12 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 12 8 2 2 2 2 2 2 2 2 2 31 2 2 2 15 2 2 2 2 2 2 1 1 1 2 2 2 1 1 1 2 2 2 1 1 1 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 10 27 2 2 2 2 2 2 2 2 2 4 4 4 4 4 4 4 4 4 16 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 13 1 1 1 1 1 1 1 1 1 26 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 26 16 27 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 26 1 1 1 1 1 1 1 1 1 29 23 2 2 2 24 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 22 26 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 30 2 2 2 14 2 2 2 28 2 2 2 16 2 2 2 2 2 2 2 2 2 26 29 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 4 4 4 11 30 4 4 4 4 4 4 5 16 27 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 16 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 16 2 2 2 2 2 2 3 27 16 39 20 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 16 1 1 1 10 16 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 14 1 1 1 1 1 1 16 33 15 16 34 16 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 5 4 18 16 3 3 3 13 3 3 3 3 3 3 25 2 2 2 2 2 2 2 2 2 17 19 Ribogroupe 87-S-3 Ribogroupe 87-S-3 1 Ribogroupe 88-S-2 Ribogroupe 88-S-2 Représentation des données sous forme d’arbres

  28. - 27 souches 87-S-3: 14 génotypes MLVA - 18 souches 88-S-2: 15 génotypes MLVA L’hypothèse d’une origine clonale pour le sérotype O12. La plus grande diversité génotypique observée pour le sérotype O11. Bilan du génotypage: arbre MLVA 1) Comparaison résolution MLVA/ribotypage:meilleure résolution du MLVA pour les souchesdes deux ribogroupes majoritaires. Données MLVA en accord avec: 2) Comparaison résolution MLVA/PFGE: équivalente pour les deux techniques testées sur 17 souches 87-S-3 testées (7 génotypes).

  29. 1) Développement d’un premier jeu de 5 marqueurs: Ex: ms127 (2 allèles) semble un bon marqueur épidémiologique: distingue les 2 ribogroupes majoritaires. Ce jeu de marqueurs peut être élargi à d’autres nouveaux marqueurs. 2) Développement de 2 marqueurs à petits motifs de 6pb: ms10 et ms61 très polymorphes. D’autres marqueurs de ce type pourraient également être développés pour constituer un jeu de marqueurs dédié à l’étude de situations épidémiques. Conclusions de l’étude MLVA P. aeruginosa

  30. 1.5 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2.5 2 2 2 2 2 2 2 2 2 4 2.5 2 2.5 3 3 3 3 3 3 3 3 3 5 4 2 2 2 2 2 2 2 2 2 6 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2.5 4 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 2 2.5 2.5 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2.5 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 2.5 3 2.5 3 3 3 3 3 3 2 2 2 3 3 3 2 2 2 2 2 2 4 4 4 4 4 4 4 4 4 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 2.5 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2.5 4 4 4 4 4 4 4 4 4 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2.5 4 4 4 4 4 4 4 4 4 2.5 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 3 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2.5 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2.5 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2.5 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2.5 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 1 1 1 1 1 4 4 4 1 1 1 4 4 4 4 4 4 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 2 2 2 2 2 2 2.5 2.5 2 2 2 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2.5 2.5 2 2 2 2 2 2 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 4 4 4 4 4 4 4 4 4 2.5 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2.5 3 3 3 3 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 5 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 5 2.5 2.5 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 4 4 4 4 4 4 4 4 4 2.5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2.5 2.5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 2.5 5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2.5 2.5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2.5 2.5 2.5 2.5 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2.5 2.5 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 Génotypes ms77

  31. 14 motifs différents: motif particulier expliquant les tailles intermédiaires (1,5U et 2,5U) Pour faciliter la comparaison de l’agencementdes allèles, un codage des motifs est réalisé. Séquençage du locus ms77 Connaître l’agencement des allèles va permettre de se faire une opinion sur la pertinence de la proximité dans l’arbre d’allèles de tailles très différentes.

  32. Les 7 allèles selon l’analyse MLVA se distinguent en 15 allèles séquencés, l’égalité de taille observée est une coïncidence (homoplasie). Résultats du séquençage du locus ms77 EK(1.5U) AFGM(4U) AFFFGM(6U) ALKKL(5U) AFGJ(4U) AF(2U) AF(2U) CM(2U) AHM(3U) ALF(3U) AHM(3U) CM(2U) EIM(2.5U) ALM ALM(3U) ALGMN(5U) EFL EFL BLFGN(5U) AFGMN(5U) EFL EFL(2.5U) DL(2U)

  33. E: GCCCATCCTGGAGTGGTCCATGCC---------------F:GGCCATCTTGGAGTGGTCCATGCCGTTCATGTCCATGCC Délétion d’un demi motif D:GCCCATCCTGGAGTGGTCCATGCCGTTCATGTCCATGCC A: GCCCATCCTGGAATGGTCCATGCCGTTCATGTCCATGCCF: GGCCATCTTGGAGTGGTCCATGCCGTTCATGTCCATGCCG:GGCCATCTTGGAGTGGTCCATGCCGCTCATGTCCATGCC Délétion de 2 motifs C: GCCCATCCTGGAATGGTCCATGCCGCTCATGTCCATGCC Résultats du séquençage du locus ms77 • Le motif E est propre à une zone de l’arbre. • EF ->D (expliquant EFL-> DL): • AFG->C (expliquant AFGM -> CM):

  34. Le marqueur ms77 est globalement cohérent. Les quelques anomalies de distribution des allèles sont résolues par un degré supplémentaire d’analyse. Développement possible du séquençage de ms142, allèles dispersés (conservation 66%), pour augmenter la résolution du typage en complément du séquençage de ms77. Conclusions de l’étude de séquençage de P. aeruginosa Marqueur reflétant des phénomènes d’homoplasie: ms77 résolution d’analyse des souches supérieure lorsque ce locus est séquencé.

  35. I. Introduction II. Pseudomonas aeruginosa III. Staphylococcus aureus IV. Conclusions et Perspectives

  36. - Bactérie Gram positif, présente dans: - la flore cutanée normale (15-30% de la population)- flore des mains- fosses nasales- flore normale de l’intestin Caractéristiques de Staphylococcus aureus • - Responsable d’infections nosocomiales(15% des infections en France). • Problème de multi-résistance des souches hospitalières (MRSA et GISA). • - Émergence de souches MRSA acquises dans la communauté.

  37. Souches MSSA. Souches MRSA. Souches GISA. Problème de comparaison entre les profils PFGE des différentes études, le MLVA pourrait permettre de faire le lien entre ces études. Collections de souches S. aureus - 107 souches du Centre National de Référence des Staphyloccoques à l’Institut Pasteur (N. El Sohl). - 30 souches du HIA Val de Grâce (JL. Koeck). Ces souches sont de différentes origines géographiques, années de prélèvement, profils de résistances aux antibiotiques et profils PFGE.

  38. 5 2 3 4 5 Stratégie de comparaison de génomes S. aureus

  39. 14 répétitions sélectionnées pour l’analyse MLVA, sur des critères de faisabilité technique et d’analyse. Les 137 souches se distinguent en68 génotypes MLVA. Bilan du génotypage, arbre MLVA S. aureus Sur 122 répétitions en tandem polymorphes, 33 ont été choisies pour typer 137 souches: • Le polymorphisme observé parmi les 6 génomes.- La taille du motif.- Choix d’amorces s’hybridant dans les 6 génomes. • + choix de quelques répétitions déjà connueschez S. aureus (spa, coa, sdr…).

  40. Tunisie Créteil 36a ~ Tunisie 2 2 2 2 2 2 2 2 2 40e Broussais 9 9 9 9 9 9 9 9 9 Blois I -1 I - 17 8 8 8 8 8 8 8 8 8 Broussais Rotschild 1 1 1 1 1 1 1 1 1 I - 5 Créteil 1 1 1 1 1 1 1 1 1 XXIV #& I -1 Créteil Tunisie I -1 I – 1 (GISA),VilliersXX (GISA),CréteilA (MRSA), Paris 2 2 2 2 2 2 2 2 2 I -1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 I -1 ~ Espagne 1 1 1 1 1 1 1 1 1 22a 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 I – 1 (GISA),BordeauxI – 5 (GISA),FinlandeI –12 (GISA), ToulouseA (MRSA), Paris ~ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 7 7 7 7 7 7 7 7 Toulouse VIb 38c Calais 2 2 2 2 2 2 2 2 2 VIb 8 8 8 8 8 8 8 8 8 Abbeville :57 1 1 1 1 1 1 1 1 1 * VIIa 37a 2 2 2 2 2 2 2 2 2 VIId 48a 45c Broussais Tunisie 3 3 3 $ 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 :3 8 8 8 8 8 8 Clichy 8 8 8 1 1 1 8 8 8 1 1 1 8 8 8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 8 8 8 8 8 8 8 8 8 VIIb #^ 1 1 1 3 3 1 1 1 3 3 1 1 1 3 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Tunisie 10 10 10 10 10 10 10 10 10 1 1 1 1 1 1 1 1 1 VIb ^ Fécamp 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Fécamp Clichy 42a B, A1, C, A2 Nimes$, #$ Abbeville##^ Fécamp& RotschildVIIa BroussaisVIId ToulouseVIId NimesVIId Blois GISA MRSA MSSA Bilan du génotypage, arbre MLVA S. aureus

  41. Validation de 14 VNTRs pour l’analyse MLVA: • 2 déjà étudiés (spa et coa).- 12 nouveaux. Difficile de se prononcer sur la résolution du MLVA par rapport au PFGE: absence de comparaison de la reproductibilité des deux techniques sur une grande collection de souches. Faut-il développer d’autres marqueurs? Il faudrait étendre l’analyse MLVA 14 locusà d’autres collections de souches. Conclusions de l’étude MLVA S. aureus

  42. Faire le lien avec les données existantes dans la littérature pour le typage de souches MRSA. Comparer la résolution de l’analyse MLVA avec celle du séquençage de deux locus. Séquençage spa et Mu50_1132 Séquençage du locus spa, déjà connu pour son intérêt pour des études épidémiologiquesde S. aureus (Shopsin B, Clin Microbiol. 1999 Nov;37(11):3556-63) Séquençage d’un nouveau locus : Mu50_1132- un des plus polymorphes parmi les 14 sélectionnés- répartition des tailles d’allèles dans plusieurs branches. Objectifs:

  43. 34 souches séquencées: BGUJFKBPE codage Mu50_1132codage spa bXKAKBBEMEKB BUJJFKBPE BGUKJFKBPE dXKB dA2AKBEMBKB BMDUKGJB HIWGKAKAOMQQQ bA2AKEEMBKB MSSA MW2 MRSA dA2AKEEMBKB HIWGAKBMQ BAMH2GJAABB b ou dXKAKBMB BOPQKUJGFMB JRMQSDZGGM BAALMMNNNYC2FMBQBLOO JYHGFO JYHGFMBQBLO BACDEFTJMBMDMGMK eYHGFMBQBLO N315 Mu50 UREKKMMNUJGBBBGGJ JKYFGFMBQBLO NCTC8325 JK YHFGFMBQBLO (ibérique) fREKKMMN UJGBBBGGJ JKYHGGFMBQBLO V WWWH2M2EGMMJK2M - Combinaison spa/Mu50_1132: 27 génotypes.- Données MLVA: en 28 génotypes. Séquençage spa et Mu50_1132

  44. Séquençage des locus spa et Mu50_1132:combinaison de locus pourrait constituer un autre schéma possible de typage de S. aureus. Ces deux locus semblent présenter un déséquilibre de liaison. Séquençage à tester sur le reste de la collectionde souches. Conclusions de l’étude de séquençage de S. aureus

  45. I. Introduction II. Pseudomonas aeruginosa III. Staphylococcus aureus IV. Conclusions et Perspectives

  46. - Actuellement pas de critères prédictifs du polymorphisme des répétitions en tandem dans les génomes bactériens. Sujet à explorer pour faciliter le développement de marqueurs polymorphes lorsqu’un seul génome est disponible. Recherche de répétitions en tandem polymorphes P. aeruginosa (riche en répétitions): - projet très prometteur initialement.- finalement très peu de répétitions polymorphes.

  47. Recherche de répétitions en tandem polymorphes S. aureus: - bénéfice évident de la comparaison de génomes pour identifier les répétitions polymorphes.- très dépendant du choix des génomes comparés. - Un certain nombre d’espèces pathogènes dont plusieurs génomes ont été entièrement séquencés, pourraient être étudiées selon cette démarche de comparaison.

  48. MLVA Le choix d’une technique dépend avant tout de la question épidémiologique posée! Comparaison des différentes techniques de génotypage - Il n’y a pas de technique « idéale » répondant à l’ensemble des critères de choix d’une technique de typage.

  49. Cette technique, dans sa forme utilisée au laboratoire, est une bonne façon de développer des marqueurs. Elle est accessible à tous les laboratoires même modestement équipés: important pour le suivi épidémiologique dans des pays touchés fortement par des maladies infectieuses. Conclusions de cette première phase de développement du MLVA

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