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Approches analytiques de l homocyst ine

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Approches analytiques de l homocyst ine

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Presentation Transcript

    1. Approches analytiques de l’homocystéine 1ères journées de pharmacie ANNABA 8 -9 Décembre 2004

    2. Plan Introduction Métabolisme Milieux Biologiques (prélèvements) Méthodes de Dosages : HPLC FPIA Conclusion

    3. Présentation de la molécule acide aminé (AA) soufré apporté par les protéines de l'alimentation fonction thiol libre: fixation aux protéines avec thiol libre (cys ou elle-même) ? disulfures Forme libre ou liée dans le plasma

    4. METABOLISME

    5. INTERET L’hyperhomocystéinémie est impliquée dans: Maladies auto-immunes Vieillissement cellulaire Maladies neurodégénératives Toxémie et avortements à répétition Insuffisance rénale

    6. Milieux biologiques Les Urines Le Sang

    7. Les Urines

    8. Les Urines

    9. ETAT DU SUJET : Jeûne de 12 h ( influence des protéines). La position du sujet. Utilisation du garrot. Arrêter certains médicaments (Méthotrexate , carbamazépine, phénytoine , 6-azaur, NO … ) Le sang

    10. Le sang (2)

    11. Méthodes de Dosage HPLC FPIA

    12. HPLC Chromatographie liquide haute performance Méthode de Référence Principe : 50µl de l’échantillon (sérum/plasma) + 100 µl de l’étalon interne +50 µl de Rf réducteur(trialkylphosphine) + 100 µl de Rf derivation (ABD-F) Incubation 5 mints à 50 °C ? Précipitation (TCA) ? Centrifugation Injection du surnageant dans la colonne (ethanol) Detection par fluorescence (? excit =385 nm/ ? emis =515 nm)  

    13. HPLC (2) Réactifs Utilisés : Phase mobile ( éthanol ) Tampon ( Acide borique ) Réactif de Dérivatisation (ABD-F) Agent Réducteur (Trialkyl phosphine) Réactif de précipitation ( Acide Tri chloro acétique) Calibrant 16 µmole/l Etalon interne Contrôles ( L1 / L2)

    14. HPLC (3) Spécifications du système HPLC : La pompe : débit 0,7 ml/min, pression 200 Kg/cm² L’injecteur : Volume 20 µl (seringue) La colonne ( T° constante de 45 ± 1 °C) Détection par fluorescence (? excit =385 nm/ ? emis =515 nm). Un Intégrateur.

    15. HPLC (4) Echantillons : Plasma ou sérum (essai en double) peut être conservé pendant 10 jours à (2 – 8 °C), à -20°C pendant 3 mois, et 4 heures à T° ambiante.

    16. HPLC (5) Chromatogramme :

    17. HPLC, Avantages VN < 15 µmol/l Linéarité : 100 µmol/l. Limite de detection : sensible, 0.5 µmol/l. Excellente Spécificité. Precision de cette méthode : Répétabilité Reproductibilité

    18. HPLC, Avantages Répétabilité : 3 plasma dosés 30 fois 1 cycle

    19. HPLC , Inconvénients Coût : méthode coûteuse nécessite un matériel approprié. Limites de la technique : Dérivatisation par ABD-F est très spécifique aux composés soufrés ? interférence des substances (gpts SH) Arrêter les Médicaments : N-acétyl cysteine, captopril, pénicillamine.

    20. FPIA Dosage immunologique par polarisation de fluorescence Principe : Hcy-SS-Hcy / Prot-SS-Hcy réduction Dithiothreitol DDT Hcy Hcy + adénosine Hydrolase S-adénosyl-L-Hcy (SAH) La SAH, entre en compétition avec SAH* marquée à la fluoresceine, pour lier un Ac anti-SAH monoclonal. Detection par fluorescence (? excit=365nm/ ? emiss=448nm)

    21. FPIA Réactifs utilisés : Solution de prétraitement (DTT +Adénosine) SAH hydrolase / tampon phosphate / conservateur. Ac Anti-SAH monoclonal de souris / Tampon phosphate. Le traceur SAH* (fluorescéine) / Tampon phosphate. Calibrateurs : 6 flacons de SAH (0, 2.5, 5, 10, 20, 50 µmol/l) Contrôles : 3 niveaux : L (5.25-8.75) cible 7 µmol/l M (10 - 15) cible 12.5 µmol/l H (20 - 30) cible 25 µmol/l

    22. FPIA Echantillons sanguins : Sérum ou plasma ( EDTA tri k+, Héparinate de Li) Centrifugation et séparation immédiate. Le plasma peut être conservé entre 2 – 8 °C pendant deux semaines, ou congelé à – 20 °C stable pendant 8 mois. Eviter les cycles de congélation /décongélation.

    23. FPIA , avantages VN : 5 – 15 µmol/l et 5 – 20 µmol/l (>60ans). Linéarité : 50 µmol/l Sensibilité : 0.5 µmol/l Spécificité : assez bonne, interférence de la SAM . Précision : 3 éch / 2 essais par jour pdt 5j analysés en double : Reproductibilité ( sur IMX) :

    24. FPIA , Inconvénients Interférences :

    25. FPIA Corrélation avec HPLC (méthode référence) : coefficient de corrélation = 0.987 ( n = 151, IMX = 0.876 HPLC + 0.312)

    26. FPIA, Etude pratique

    27. MALADIES DU SYSTEME

    28. DIABETIQUES

    29. HYPERTENSION ARTERIELLE

    30. DYSLIPIDEMIES

    31. AVC

    32. THROMBOSES VEINEUSES

    33. MALADIES NEURODEGENERATIVES

    34. AVORTEMENTS A REPETITION

    35. INSUFFISANTS RENAUX

    36. Tableau récapitulatif: Principales caractéristiques des méthodes les plus utilisées

    43. Conclusion

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