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MANIPULAÇÃO DO DNA in vitro : DNA- recombinante e PCR

MANIPULAÇÃO DO DNA in vitro : DNA- recombinante e PCR. CLIVAGEM DO DNA EM FRAGMENTOS. Análise Molecular do DNA – somente possível fragmentando o DNA em pequenos tamanhos :

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MANIPULAÇÃO DO DNA in vitro : DNA- recombinante e PCR

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Presentation Transcript

  1. MANIPULAÇÃO DO DNA in vitro: DNA- recombinante e PCR

  2. CLIVAGEM DO DNA EM FRAGMENTOS Análise Molecular do DNA – somente possível fragmentando o DNA em pequenos tamanhos: através de endonucleases de restrição (enzimas bacterianas que clivam internamente o DNA) ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO Tipo de nuclease que cliva uma cadeia dupla de DNA sempre que identificar uma sequência específica de 4 a 8 pares de bases, produzindo um grupo 3’- OH em uma extremidade e um grupo 5’- fosfato na outra. As sequências reconhecidas apresentam nas duas cadeias complementares sequências idênticas mas invertidas: PALÍNDROMO.

  3. CLIVAGEM DO DNA EM FRAGMENTOS • NOMENCLATURA DAS ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO • Denominação de acordo com o organismo da qual foi isolada. • Primeira letra corresponde ao gênero do microrganismo. As duas letras seguintes referem-se a espécie e um número final indica a ordem da descoberta da enzima no organismo. • Ex:. Hae III (3º ER isolada da bactéria Haemofilus aegyptius)

  4. CLIVAGEM DO DNA EM FRAGMENTOS

  5. CLIVAGEM DO DNA EM FRAGMENTOS • DNA LIGASE Enzima que promove a ligação dos fragmentos de DNA em vetores previamente clivados por endonucleases de restrição. O DNA ligase requer um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias de DNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra cadeia.

  6. REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) HISTÓRIA Ferramenta que permite amplificar uma seqüência específica de DNA (seq. alvo) em milhões de vezes dentro de poucas horas (Xerox) PCR citada em mais de 200.000 trabalhos científicos (08/2005)

  7. REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

  8. 1c 1a 2c 2a P 3c 3a 4c 4a 5c 5a 6c 6a PCR P = padrão de tamanho molecular lambda Hind III Nc = controle sem DNA molde Ne = amostra com DNA molde – sem resultado positivo (molde?) Gel será refeito utilizando-se outros PCRs Bandas visíveis [Gel de agarose 1% corado com brometo de etídio e fotografado sob luz UV]

  9. CROMATOGRAFIA POR SOUTHERN BLOT 2. HIBRIDIZAÇÃO DA SONDA A FRAGMENTOS DE DNA

  10. ANÁLISE DE POLIMORFISMOS DE DNA (RFLP)

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