Técnicas de muestreo para el control microbiológico.

1. Técnicas de muestreo para el control microbiológico. Dr. Keiko Shirai

2. Muestreo • Es la sucesión de pasos para asegurar que la muestra  posea las características esenciales del lote. Muestra • Una porción de material tomada y seleccionada de tal forma que sea representativa del lote (IUPAC).

3. La muestra seleccionada para el análisis debe ser representativa del lote entero del alimento y lo suficientemente grande para poder llevar acabo todas las determinaciones. • La técnica de análisis sea ejecutada con estricto apego a la metodología establecida. • Comparación con normas o estándares de calidad

4. Para realizar un muestreo en forma práctica se utiliza el "Sentido Común". La experiencia de los procesos de fabricación permite que el muestreo puede resolverse al tanteo. • Ejemplo 1: tomando muestras al principio y al final de la jornada; • Ejemplo 2: tomando como muestra el último producto de cada serie (como se hace con algunos alimentos precocidos y congelados).

5. Criterios Generales de Muestreo. • Todo el material que se use debe esterilizarse y envolverse. • Al colectar la muestra hay que evitar contaminación del ambiente (polvo, tierra, agua, saliva). • Rotular o etiquetar. • Consignar información que pueda afectar la prueba o el significado del resultado. Por ejemplo la presencia de algún conservador, olor, color, condiciones de conservación, temperatura.

6. Para muestras sólidas se recomienda un peso de 100 gramos. Si se encuentra a granel o en recipientes o piezas grandes habrá que retirar porciones de diferentes puntos para integrar una muestra representativa. O bien manejar varias muestras independientes de áreas que se considere pueden tener mayor riesgo. • En productos como carne y pescado deben tomarse muestras de la superficie y profundas (minimizando la contaminación de la superficie). • En alimentos congelados  se pueden usar sacabocados para tener muestras sin descongelar.

7. Transportar muestras de alimentos perecederos bajo refrigeración (2-8°C) o en congelación si son alimentos congelados. Evitar agua de deshielo que pueda contaminar el alimento. • Reducir el tiempo comprendido entre recolección y entrega de la muestra. • Muestras líquidas deben encontrarse homogéneas, emplearse de 100 a 500 ml. • Obtención de muestras superficiales mediante transferencia de pedazos con la ayuda de bisturí y pinzas, uso de isopos inertes estériles humedecidos en solución diluyente estéril. Para determinar anaerobios estrictos se debe exponer lo menos posible a la atmósfera y usar líquidos de dilución con bajo potencial redox como el medio de Stuart (con tioglicolato) o medio enriquecido para clostridios (con cisteína).

8. Técnicas de manejo de muestras. Dilución para conteo de microorganismos viables • Si es muestra líquida congelada fundirla y homogeneizarla. No es recomendable que el producto llene totalmente el recipiente para evitar escurrimientos y contaminación. • Para muestras sólidas se pesan 10 gramos y se diluyen en 90 ml de solución diluyente, se licúa o se puede usar un mortero estéril. Se considera como la primera dilución. Para las diluciones sucesivas se usan pipetas diferentes inoculando simultáneamente a las cajas petri. • El volumen que se transfiera nunca será menor del 10% de la capacidad total de la pipeta, por ejemplo para 0.1 ml no se usa una pipeta de más de 1 ml.

9. Diluyentes de uso general • Agua peptonada 0.1% pH 6.8-7 • Solución amortiguadora de fosfatos 0.1M pH 7 • Solución de Ringer • Medio enriquecido para clostridios • Solución de sacarosa al 20% o NaCl al 15%, osmófilos y halófilos respectivamente.

10. Cuenta en placa Consiste en contar colonias que se desarrollan después de cierto tiempo en el medio de elección presupone que cada colonia proviene de un microorganismo en la muestra. • Vertido • Superficie

11. Reglas para conteo en placa • Seleccionar aquellas placas donde aparezcan de 30 a 300 colonias, pues hay menor error en el conteo. • Contar todas las colonias de la placa. Si el número se estima mayor de 300 y no hay diluciones subsecuentes: • 301-500 colonias se divide en dos partes y el número de colonias contadas se multiplica por 2. • 501-800 colonias se divide en cuatro partes y el número de colonias contadas se multiplica por 4. • >800 colonias se cuentan de 10 a 20 cuadros se promedia y se multiplica por el número de cuadros que ocupa la caja. • El número de colonias contadas deberá ser multiplicada por el inverso de la dilución y considerar si la técnica fue por vertido o por superficie (debido al volumen de la muestra). • Redondear la cifra obtenida en el recuento de tal forma que haya dos dígitos al inicio de la cifra por ejemplo: 129 se reporta 130 2,417 se reporta 2400 49 se reporta 49

12. Recuento en tubo • Son técnicas empleadas para el análisis de muestras que supone una concentración de microorganismos pequeña. • Es una estimación de la densidad de bacterias en el alimento. Tiene una base estadística que sería la probabilidad de obtener tubos con cultivo positivos va a disminuir conforme es menor el volumen de muestra inoculada. • Permite la inclusión de agentes selectivos y se utiliza cuando se requiere de un medio enriquecido previo a la identificación de un grupo microbiano.

13. Pruebas presuntivas • Frecuentemente se utiliza como una etapa de enriquecimiento que busca aumentar la concentración de microorganismo de interés. • Se considera positivos aquellos que después de incubados presenten enturbiamiento, cambio de color, formación de gas. Ejemplo para coliformes fermentación de carbohidratos como caldo lactosado.

14. Pruebas confirmativas • De los tubos positivos de la prueba presuntiva se inoculan a la prueba confirmativa. El número de tubos positivos y negativos determinará el Número Más Probable mediante el uso de una tabla en la cual se estima la concentración de microorganismos en el alimento. • Ejemplo para coliformes caldo lactosa bilis verde brillante o agar EMB. Medio VRB+ colorante fluorescente con desarrollo deEscherichia coli ATCC 11775

15. Número Más Probable

16. Tabla Número Más Probable