Mehanizmi toksičnosti

1. Mehanizmi toksičnosti dr Mirjana Đukić, vanr. prof. Institut za toksikološku hemiju Farmaceutski fakultet, Univerzitet u Beogradu

2. Izmenjena homeostaza Promene u ćelijskoj homeostazi Normalna homeostaza nivoi homeostaze reverziblno Point of no return degradacija ireverzibilno nekroza vreme Oštećenje 3

3. Faze u homeostatskim promenama • Inicijalna faza: Promene u ćelijskom okruženju koje posledično determinišu ćelijski odgovor na oštećenje. • Reverzibilnafaza: Ćelijske promene koje su reverzibilne po uklanjanju uzročnika oštećenja ili reparaciji oštećenog. • Ireverzibilnafaza: Promene u ćeliji koje se dešvaju na kritičnom nivou “tačke bez povratka” • Nekrotična/apoptotičnafaza: Karakteristične degenerativne promene koje vode ćelijskoj smrti 4

4. Toksični efekti na ćelijskom nivou 1/2Proteini – glavna meta toksičnog delovanja • enzimi (proteinski katalizatori reakcija) • inhibicija • aktivacija (indukcija enzima (povećana ekspresija, npr. P450)) • receptori (na površini ćelije ili ćelijskih struktura) • agonisti/antagonisti • jonski kanali (regulišu prolaz jona kroz membranu) • kompeticija za prolaz, (inhibicija jonskog “fiziološkog” transporta, udvojeni nosač-proteinski transport) • menjanje konformacije kanalskih peptida • povećana ekspresija proteina (metalotioneini) • transporni proteini (hemoglobin) • ometanje funkcije (npr. karboksihemoglobin, methemoglobin) • citoskelet (tubulin, aktin) • oštećenje strukture proteina (hemijsko, fizičko) • antitela (imuni sistem) • imunotoksikološke reakcije

5. Toksični efekti na ćelijskom nivou 2/2Ostali mehanizmi • Ćelijska smrt • remećenje ćelijske signalizacije, ushodnih i nishodnih regulacionih puteva • nekroza • apoptoza • Reakcije sa drugim biomolekulama • DNA/RNA - direktne reakcije sa hromatinskim materijalom, ometanje transkripcije i sinteze proteina (mutagenost i karcinogenost) • lipidi - poremećaj metabolizma i lipidna peroksidacija • Hormoni • ometanje medjućelijske signalizacije • Oksidativni/nitrozativni stres • (produkcija slobodnih radikala, utrošak reduktivnih ekvivalenata (GSH, NAD(P)H) • Remećenje intraćelijske homeostaze i redistribucije Ca2+ i drugih jona • Energetsko iscrpljivanje ćelije • (utrošak ATPa, glikoliza,...)

6. Enzimi kao target toksikanata • enzimi katalizuju neku specifičnu reakciju: supstrat + enzim (aktivno mesto) = produkt + enzim (hemijski neizmenjen) produkt + enzim (alosterno mesto) smanjuje aktivnost enzima Vmax Vmax/2 Km Koncentracija supstrata

7. Reverzibilna (nekovalentna veza) kompetitivna inhibicija (povećana je Km, a Vmax je nepormenjena ako ima dosta substrata) nekompetitivna inhibicija (vezivanje otrova za alosterno mesto) Km je ista ali je smanjena Vmax Ireverzibilna (kovalentna veza) Pirmer inhibicije acetilholineseraze organofosfatima (OF) vezivanjem AcH za serin (aktivno mesto AcH Est) enzim se acetiluje, a vezivanjem OF se fosforiliše fenomen strarenja enzima (dealkiliše se fosforna grupa) Inhibicija enzima dejstvom otrova

8. AChE AChE Fosforilacija AChE X = Napuštajuća grupa Paration OP Insecticide Primer: Inhibicija AChE OP reaguje sa serin reziduom (X se hidrolizuje) Activno mesto AChE se ‘ireversibilnofosforiliše’

9. O XO P OC3H7 H7C3O N: HO 1)Regeneracija AChE oksimima2)Fenomen starenja AChE-OP oksimi su bez efekta OP • Oksim se vezuje za anjonsko mesto i gradi se kompleks sa OP-estrom • kompleks disocira odvaja se od AChE • Dealkilacija OP: ‘starenje’ • Dalja stabilizacija kompleksa OP-AChE • oksim bez efekta AChE - H Oxim O C N OH P N+ Dealkilacija OP “starenje” H7C3O OC3H7 CH3 N: O - H O- C N O N+ P H3C H7C3O OC3H7 N+ H O - H O O C N N+ P CH3 OC3H7 H7C3O RegenerisanaAChE N: HO - 32

10. Cl- GABA A receptor Primer: ligand (neurotransmiter)/receptor Antagonisti GABA receptora: blokiraju ulazak Cl- • Organohlorni insekticidi: • cikloheksadieni i • g-heksahlorcikloheksan (lindan) • a-endosulfan • ‘POPs persistent organic pollutants (dieldrin, aldrin) • Aldrin nije toksičan za insekte, u telu insekta se oksidiše do dieldrina – aktivni metabolit izazivaju konvulzije Koriste receptorsko mesto za pikrotoksin(cocculin) biljni alkaloid – iz semena biljke Cocculus indicus - nekompetitivni antagonist GABA A receptora

11. Primer: ligand (neurotransmiter)/receptor Antagonist acetiholinskog receptora: kurare alkaloid katjoni (N+, K+, Ca2+) Nikotin agonist Curare (mišićni relaksant) antagonist Acetiholinski receptor

12. Primer: ligand - receptor interakcija Aktivacija G-proteina Primer: MUSKARIN = agonist ATROPIN = antagonist GPLR = muskarinski acetilholin receptor

13. Primer: Inhibicija CYP_P450 • potentni inhibitor CYP_P450 enzyme CYP3A4 • bioraspoloživost nekih lekova • Letalni ishodi kod antihistaminika Astemizol

14. Primer: Indukcija enzima P450 • citohrom P450-zavisne monookigenaze • velika grupa metaboličkih enzima jetre Dioxin-Ah receptor kompleks Ah receptor u citoplazmi (jetre) DNA povećana transkripcija gena za sintezu CYP1A (koja ga metaboliše)

15. Inhibicija mitohondrijalnih enzima • primer energetskog iscrpljivanja ćelije (nedovoljma produkcija ATP)

16. Transportni i depo proteini Primeri toksičnih mehanizama CO, nitrita i Cd Transportni proteini • Hb (smešten u eritrocitima i ima funkciju prenosa O2) • sadrži 4 subjedinice (aminokiselinske rezidue sa hem grupom-sadrži Fe) koje mogu vezati 4 atoma kiseonika. • CO – karboksihemoglobinemija • Nitiriti - methemoglobinemija Depo proteini • Fe u feritinu, apoferitinu • Cu u ceruloplazminu • Cd može da zemeni Fe i Cu u različitim citoplazmatičnim i membranskim proteinima Onemogućena distribucija kiseonika do tkiva ANOKSIJA

17. Primer inhibicije antioksidativnih enzima kadmijumom (Cd) • Antioksidativnienzimisu metal-zavisni, odnosnosadržejonemetala u aktivnom centu : • Superoksid diymutaza (SOD): Cu/Zn-SOD (citosol)iliMn-SOD (mitohondrije), • Katalaza (CAT) i gluttion reduktaza (GR): Fe • Glutation peroksidaza (GSH-Px): kofaktor je Se. • Cd • kompetitivna inhibicijazaistepoložajenaenzimuzakoje se vezujunavedeni metalnijoniiliuticatinanjihovekofaktore, • promene u regulacijitranskripcijeitranslacijeovihenzima

18. Povećana ekspresija proteina Primer: metalotioneini Metalotioneini (MT) sadrže cistein-tiolatne grupe koje vezuju jone metala i grade metal-tiolatne grupe koje reaguju sa slobodne radikalima (SR): O2 i HO • stvaraju se tokom oksidativnog stresa i imaju antioksidativnu ulogu • parakvat • 36 puta je povećan sadržaj MT u jetri po • akutnom trovanju • tokom redoks metabolizma stvara O2 • Cd • povećan sadržaj MT po akutnom trovanju • ndirektno stvara HO kroz povećanje sadržaja Fe ili Cu (povećano oslobađanje iz (apo)feritina) • Fenton reakcija Sadržaj Fe u jetri miševa akutno trovanih sa 20 mg Cd/kg t.m. Djukić-Ćosić D i sar. J Trace Elem Med Biol 2008.

19. inaktivni enzim Ca2+ CaM kalmodulin Ca2+ Ca2+ Ca2+vezivanje menja konformaciju kalmodulina aktivni enzim Aktivacija/inhibicija ezimazavisnih od Ca2+ - kalmodulinskog kompleksa (1/2) • cGMP fosfodiesteraza, • Kalcineurin, • NO-sintaza, • miozin-”light-chain” kinaza agonizam i antagonizam Aktivacija enzima CaM-zavisni proteini su regulatori brojnih ćelijskih porcesa (ekspresija gena i progresija ćelijskog ciklusa) mesto inhibicije 10

20. P P ATP ATP ADP ADP + + Ca 2+-ATPaza u endoplazmatičnom retikulumu Ca 2+-vezujući proteini u citoplazmi Ca 2+ aktivniutok u mitohondrije Ca 2+ Ca 2+ ER Ca 2+ Ca2+- vezujuće molekule Intraćelijska homeostaza kalcijuma Na +-ulaz Ca 2+-antiport nosač protein upareni transport Ca 2+-ATPaza Ca2+ - sekundarni glasnik Ca 2+ Ca 2+ plazma membrana [Ca 2+] ~ 10-3 M Na + [Ca 2+] ~10-7 M CITOPLAZMA mitohonrije 24

21. Hg i drugi TM ksenobiotici Endotoksin Jonofore Oskdiativni stres Povećan utok Ca 2+ - Acidoza Narušavanje citoskeleta [Ca 2+] u citosolu Ca 2+ - povećan utok u mitohondrije Aktivacija fosfolipaza Narušavanje ćelijske arhitetkture Povećana membranska permeabilnost Bubrenje ćelije Bubrenje endoplazmatičnog retikuluma Bubrenje mitohondrija “Point of no return” Tačka bez povratka Oksidativna fosforilacija zgrušnjavanje i mitohondrijalna kalcifikacija Ireverzibilno oštećenje ćelije Ca2+ influksom 18

23. Oksidativni stres i antioksidativni sistem Di Giulio, 1989

25. oksidovana redukovana + Mehanizam reakcija slobodnih radikala nespareni elektron elektron transfer + Slobodni radikal Ciljna molekula 11

26. Stvaranje reaktivnih vrsta/slobodnih radikala u organizmu • u fiziološkim uslovima tokom: a) procesa oksidativne fosforilacije u mitohondrijama, tj. ćelijskog disanja, b) oksidoredukcije u prisustvu metala sa promenljivom valencom, c) autooksidacije brojnih malih molekula (npr. autooksidacija dopamina u mozgu); • u inflamaciji: tokom procesa fagocitoze; • u bolestima: autoimune bolesti, neurodegenerativne, maligne, kardio-vaskularne, profesionalna oboljenja radnika eksponiranih dejstvu toksičnih supstanci, kao i u različitim nefiziološkim uslovima, kao što su ishemija, hipoksija, hiperoksija, reperfuzija; • biotransforamcijom ksenobiotika(u endoplazmatičnom retikulumu, posredstvom sistema mešovitih oksidaza): a) tokom metabolisanja egzogeno unetih jedinjenja (hrana, lekovi, itd) i kod profesionalne ekspozicije potencijalno toksičnim jedinjenjima b) dejstvom spoljašnih faktora sredine (UV zračenje, jonizujuće zračenje, aerozagađenje); • pri pojačanoj fizičkoj aktivnosti • pri trovanjima metali redoks ciklizirajuća jedinjenja. • Parakvat • Nitro aromatična jedinjenja • Hinoni

27. mijeloperoksidaza H2O2+ Cl- + H+ hidrogen peroksid H2O + HOCl hipohlorna kiselina Produkcija superoksidnog anjona i hipohlorne kiseline u fagocitima 6

28. O R R' O2¯ • O OH R R' O ¯ Ksenobiotici i stvaranje SR sa primerima (1/2) ADR hinon Redoks ciklizacija adriamicina NADPH mikrozomi ADR Semi hinon NADP O2 Fentonova reakcija Men+ + H2O2 Me(n+1)+ +HO+ OH 17

29. O O O H O2 C C H O H 2 O H H O Superoxide anion H C O O O H 3 Hydrogen peroxide H2O2 O 1e- H C 1e- 3 O Singlet oxygen ‘O2 N H OH B 2 O H O Molecular oxygen Hydroxyl radical OH O H C C H O H 2 O H Lipid peroxidation . H O H C O O O H 3 Protein and nucleic acid damage O H C 3 O O2 N H 2 O H Unsaturated membrane lipids Lipid radicals Lipid peroxide Semiquinone free radical Oxygen addition A Redoks ciklizacija adriamicina (doksorubicina) detaljnije NADPH NADP 35

30. O2.- +NO.ONOO- +H+ NO2. +.OH Produkcija peroksinirinog anjona i hidroksil radikala u fagocitima Nitrozativni stres 8

31. + R• + RH X Y X Y H Formiran lipidni radikal je stabilan, jer je slobodni elektron delokalizovan svojom rezonantnom strukturom: X Y X Y X Y O Lipidni radikal reaguje brzo sa kisonikom O + O 2 X Y X Y Stvoren lipidni peroksil radikal abstrakuje H od sledeće polinezasićene masne kiseline i stvara se lipidni hidroperokisd i novi lipidni radikal O H O O O + X ' Y ' + X ' Y ' X Y X Y H Lipidna peroksidacija • • • • • • • • 18

32. C H 3 H O . LOO C H 1 6 3 3 O H C C H 3 3 C H 3 a -tokoferol . C H 3 O C H LOOH 1 6 3 3 O H C C H 3 3 C H 3 a -tocoferol radikal vitamin E - lipofolni antioksidans lipidni peroksil radikal lipidni hidroperoksid 17

33. C O H H 2 HCOH O O O O N H 2 O H C C H C H C N H C H C N H C H C O H 2 2 2 H C O O H C H 2 H O OH S H Antioksidansi-međusobno... C H . C H 3 3 HO O C H C H 1 6 3 3 1 6 3 3 O O H C C H H C C H 3 3 3 C H 3 C H 3 a-tokoferol 3 a-tokoferol radikal C O H H 2 HCOH O redukovan glutation O ascorbate H O O O N H O. 2 HO H C C H C H C N H C H C N H C H C O H askorbil radikal 2 2 2 C O O H C H 2 . S Glutation tiil radikal 20

34. Oštećenje proteina • Dejstvom slobodnih radikala dolazi do njihove oksidacije i posledičnog unakrsnog vezivanja. • Takođe do oštećenja dolazi zbog vezivanja sa molekulima šećera- proces glikozilacije. Kombinacija procesa oksidacije i glikozilacije dovodi do cepanja proteina, poremećaja integriteta membrane i ubrzanja ćelijske smrti. • Dejstvo ksenobiotika, kao što su teški metali, insekticidi i druga jedinjenja, mogu dovesti do oštećenja strukturnih proteina i inaktivacije enzima.

35. Oksidativno oštećenje proteina • Unakrsno vezivanje proteina može biti posledica i dejstva malondialdehida (MDA), produkta lipidne peroksidacije, koji može formirati kovalentne veze sa ostacima lizina u polipeptidnom lancu. • Hidroksil radikal takođe dovodi do unakrsnog vezivanja formiranjem ditirozinskih mostova. • Oksidovani i unakrsno vezani proteini su rezistentni na degradaciju i zbog toga doprinose akumulaciji oštećenih proteina u mnogim degenerativnim procesima.

36. Proteini mogu biti i direktno oksidovani. Najosetljivije aminokiseline na dejstvo reaktivnih kiseoničnih i azotnih radikala su cistein i metionin. • Oksidacija cisteina može biti kritična za strukturu proteina zbog njegovog učešća u formiranju disulfidnih veza. • Metionon-sulfoksid (nasuprot tome) se lako prevodi u metionin pod uticajem reduktaze -jedinog “repair” mehanizma proteinske oksidacije.

37. Unakrsno vezivanje proteina sa produktima lipidne peroksidacije CH NH2 NH OHC CH2 CHO + protein MDA N intramolekularna ciklizacija protein CH CH NH2 OHC CH2 CHO + 2 protein NH2 protein NHCH CH CH N protein intramolekularno ukrštanje 31

38. Degradacija oštećenih proteina • Organele odgovorne za degradaciju većine oksidovanih proteina su proteozomi koji sadrže brojne enzime proteaze. • Peptid ubikvitin se vezuje za regulatorne i neregulatorne proteine i obeležava ih za degradaciju u proteozomima i tako obeležene bivaju prepoznate od strane proteaza.

39. Oksidativne promene na DNK • OHjenajjačioksidant DNK, oksidiše šećernukomponentu,kidalanac DNKioslobađajuse baze. • hromozomskeaberacije, aktivacijaonkogena, apoptoza (programiranaćelijskasmrt),... • radiolizom H20nakonzračenja 7-8 putaje povećanostvaranje 8-hidroksideoksiguanozina (8-OhdG) i 5-hidroksimetil uracila (potiče odtimina).

40. Reparativni enzimiDNK • DNK endonukleaze • AP endonukleaze • pirimidin-hidrat-DNK glikozilaza • -liaza • -liaza • dezoksifosfodiesteraza • 3-reparišuće diesteraze • DNK polimeraze • DNK ligaze • DNK- reparišuće nukleaze IRP-1,2

41. Ekscitatorne amino kiseline • Glavni uzročnik ćelijske smrti u n.s. je glutamat • Toksičnost glutamata se ispoljava putem: • receptorne – inicirane ekscitotoksičnosti • nereceptorski – posredovanom oksidativnom toksičnošću • prevenira ulazak cisteina u ćelije • to smanjuje intraćelijski cistein i – GSH • U HT22 ćelijama (hipokampalna ćelijska linija) glutamat indukuje programiranu ćelijsku smrt sa karakteristikama nekroze i apoptoze (Shirlee Tan et al. 1998)

42. Ćelijska smrt NEKROZA -patološki događaj- • Biohemijski uzročnici nekroze mogu biti: • Vezivanje reaktivnih metabolita za proteine, lipidna peroksidacija, povećan ćelijski influks Ca2+, narušena ravnoteža izmene Na+ i K+, inhibicija sinteze proteina, interferiranje metaboličkih puteva,.... • aktiviše se kao brz odgovor u slučaju jakih insulta (anoksija, trauma) APOPTOZA -fiziolioški događaj- • udružena je sa aktiviranjem “genetskog programa”, programirane ćelijske smrti • održava homeostazu organizma, kontradešavanje ćelijama u deobi, mitozi (embriogeneza, neurogeneza) • aktivira se i u patološkim događajima ili dejstvom ksenobiotika • odložena forma ćelijske smrti (insulti manje jačine)

43. Morfološki kriterijumi APOPTOZA • Zgušnjavanje (shrinkage) citoplazme i kondenzacija jedra (clumps) • Fragmentacija jedra • Fuzija EPR sa plazma membranom • Ćelijska fragmentacija (apoptotična telašca) – intaktne citoplazmatske organele i fragmenti jedra NEKROZA • Bubrenje (swelling) ćelije i organela • Dezintegracija organela, ruptura plazme membrane (dissolution) • Izlazak ćelijskog sadržaja u EĆ prostor • Degradacija DNK praćeno proteolizom histona • Uglavnom pogađa velike grupe ćelija • Praćena je inflamatornom reakcijom

44. Aldehidi i polarizovana dvostruka veza Epoksidi i neke laktonske strukture Alkil sulfati Aril karbonijum joni Benzil karbonijum joni i nitrozo grupe Alkil karbonijum joni Tiolnegrupe proteina i GSH Sumpor umetioninnastavcima Primarne (arginini lisin) i sekundarne (histidin) amino grupe Amino grupe u purinskim bazama (DNA, RNA) Kiseonik u purinskim i pirimidinskim bazama Karcinogeneza Nukleofilna mesta u makromolekulama - mete elektrofila Elektrofili poređani po rastućoj toksičnosti 22

45. - Methionine Guanine + - Cysteine + Adenine Histidine + Tyrosine Cytosine - + Alkilacija amino- and nukleinskih kiselina - 21

46. Adhezija neutrofila tokom oksidativnogoštećenja 29

47. Oštećenje citoskeleta peroksidom 30

48. Brzo starenje neurona usled lipidne peroksidacije kod pasa 32

49. Brzo starenje neurona usled lipidne peroksidacije kod ljudi 33