ANALISIS TOXICOLOGICO SISTEMATICO DE 1,4 BENZODIAZEPINAS EN MUESTRAS POSTMORTEM POR HPTLC-UV Y GC-ECD

1. ANALISIS TOXICOLOGICO SISTEMATICO DE 1,4 BENZODIAZEPINAS EN MUESTRAS POSTMORTEM POR HPTLC-UV Y GC-ECD Q.F. EDUARDO TORRES S. QUÍMICO FARMACÉUTICO FORENSE DEPARTAMENTO DE LABORATORIO SERVICIO MEDICO LEGAL SANTIAGO – CHILE PROFESOR ACADEMIA DE CIENCIAS POLICIALES CARABINEROS DE CHILE

2. ESPECIES POSTMORTEM • Contenido Gástrico • Sangre • Hígado • Humor Vítreo • Músculo Esquelético • Tejido Óseo

3. TÉCNICAS DE PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS: • Pre – tratamiento según muestra y procedimiento de separación. Homogeinización Digestión Ácida a 100º C Hidrólisis Reflujo • Extracción Extracción Líquido-Líquido con mezcla cloruro de butilo – eter a pH 9. Purificación por retro- extracción (partición entre ácido sulfúrico diluido y posterior partición entre hexano) y re-extracción con acetato de etilo, luego de alcalinizar con amoniaco.

4. MÚSCULO ESQUELETICO El músculo esquelético es indicado para el análisis cualitativo pero no como una corroboración cuantitativa de una muestra de sangre o como una alternativa cuantitativa. Las concentraciones de drogas comúnmente sonmas altas que en otros músculos, como resultado del mayor flujo sanguíneo, correspondiente a un músculo de la respiración. A.M. Langford, Departament of Forensic Medicine. University of Dundee, Scotland.

5. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Pesar 5 gramos de músculo (diafragma), cortar finamente y homogeinizar con 15 mL de agua destilada en un blender y centrifugar a 3500 rpm por 10 minutos Extraer 2 mL del homogeinizado, según sistemática analítica toxicológica para sangre.

6. HUESO Análisis de hueso postmortem para drogas de importancia en toxicología forense. La capacidad de extraer y detectar drogas en muestras de hueso postmortem no ha sido ampliamente estudiada. La importancia de la investigación en el campo de la toxicología postmortem es especialmente para cuerpos quemados y descompuestos. El hueso es extremadamente vascularizado, recibe entre un 10 a un 20% del gasto cardiaco, que varia según el tipo de hueso, localización, tamaño y forma (largo, irregular, corto y plano). Cresta iliaca, vértebra y fémur.

7. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA • Remover y limpiar la muestra ósea de cualquier adherencia de músculo y tejido, lavar con agua desionizada y secar a temperatura ambiente. • Cortar en astillas y practicar reflujo con metanol por aproximadamente 16 horas. • Evaporar y redisolver en buffer pH 9.2 amonio cloruro – amoniaco.  • Extraer con cloruro de butilo.

8. Continuación Resultados obtenidos en estudios practicados para Diazepam y Nordiazepam. Diazepam: 0.13 – 0.39 ug/mL y 0.60 – 2.4 ug/g en sangre y hueso respectivamente. Muchos factores influyen en la disposición de drogas en hueso, como la distribución de drogas al tiempo de muerte, entre otros. Procedimientos toxicológicos forense postmortem pueden ser aplicados para detectar drogas en hueso, ya que cuando la droga está presente en sangre, las concentraciones tienden a ser mayores. Kelly K. McGrath and Amanda J.Jenkins The Office of the Cuyahoga County Coroner Cleveland, Ohio 44106 USA

9. HUMOR VITREO Cambios postmortem (descomposición o quemados) producen desnaturalización de la sangre, resultando una disminución o degradación de la droga, siendo el humor vítreo, una matriz simple, menos afectado por estos cambios, permitiendo una estimación mas real de las concentraciones antemortem de las drogas. Es posible detectar y cuantificar niveles de Benzodiazepinas en humor vítreo, como una alternativa cuando la sangre y la orina no están disponibles postmortem. Karen S. Scott Departament of Forensic Medicine & Science University Place, Glasgow.

10. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Cantidad de muestra según volumen disponible, extraer según sistemática analítica toxicológica, obviando, por su composición, las etapas de purificación.

11. HIGADO Preparación de la muestra. • Pesar 5 gramos de hígado, cortar finamente y homogeneizar con 15 mL de agua destilada en un blender. • Extraer 2 mL del homogeinizado según sistemática analítica toxicológica para sangre.

12. SANGRE Preparación de la muestra. • A 2 mL de sangre se adicionan 100 uL de solución de estandar interno (prazepam 10 uL, 1 mg /mL), alcalinizar con amoniaco y extraer con mezcla cloruro de butilo y eter (80:20) (7 mL). • Agitar por tres minutos y centrifugar a 2500 rpm por 10 minutos. • Traspasar la fase orgánica a otro tubo de centrífuga y agregar 2,5 mL de ácido sulfúrico 2.5 N. Agitar por 3 minutos y centrifugar a 2500 rpm por 10 minutos. • Descartar la fase orgánica, adicionar 2 mL de hexano, agitar por 1 minuto y centrifugar a 2500 rpm por 10 minutos. • Descartar el hexano, alcalinizar con amoniaco a pH 9 y re-extraer con 4 mL de acetato de etilo. • Evaporar y redisolver en 50 uL de metanol.

13. Preparación de la muestra de sangre para la detección de Benzofenonas ej. Clonazepam 4 mL de muestra se digieren en medio ácido clorhídrico (hidrólisis ácida) en baño de agua a 100ºC obteniéndose ANCB (2-amino-5-nitro-2‘ clorobenzofenona), correspondiente al Clonazepam. La sensibilidad por el Método de hidrólisis para alprazolam, clonazepam y triazolam puede ser aumentada extrayendo hasta 4 mL de sangre o plasma con lo cual la sensibilidad para el Clonazepam es alrededor de 0.15 ng/mL, equivalente aproximadamente a 50 pg de benzofenona inyectada. Alprazolam y triazolam son estables a la hidrólisis ácida y no forman benzofenonas. Para la extracción en el digesto, proceder como en la muestra sangre.

14. Cromatografía, usando TLC y Derivatización Post-cromatográfica por la reacción de Bratton-Marshall.Fase móvil: cloroformo-acetona 90:10 2-amino-5-nitro-2’ clorobenzofenona ANCB 30ng Benzofenona correspondiente al Lorazepam

15. Espectrograma, usando HPTLC-UV, de Clonazepam 0,65 ug Fase móvil: Acetato de Etilo

16. Espectrograma, usando HPTLC-UV, de Diazepam 1,0 ug Fase móvil: Acetato de Etilo

17. Espectrograma, usando HPTLC-UV, de Alprazolam 1,0 ug. Fase móvil: Cloroformo-Alcohol isopropilico- A.Acético ( 85-10-5)

18. Cromatograma, usando HPTLC-UV, de Alprazolam 1,0 ug Fase móvil: Cloroformo-Alcohol isopropilico- A.Acético ( 85-10-5)

19. Espectrograma, usando HPTLC-UV, de Midazolam 0,80 ug Fase móvil: Cloroformo-Alcohol isopropilico- A.Acético ( 85-10-5)

20. R o 1 N R 3 N R 4 R 2 Benzodiazepinas Clásicas R1 R2 R3 R4 CH3 H H Cl - Diazepam H H H Cl - Nordiazepam H H OH Cl - Oxazepam CH3 H OH Cl - Temazepam H Cl OH Cl - Lorazepam H Cl H NO2 - Clonazepam H H H NO2 - Nitrazepam CH3 F H NO2 - Flunitrazepam

21. Cromatograma, usando ECD, de 1,4 benzodiazepinas, en orden ascendente de tr. Lor Alpra Instrumento: Clarus 500 Programa de tº tº inic: 220 ºC Hold Inic.: 1 min Rampa 10,0/min a 300ºC, Hold por 5 min. Clona Nordia Dia Mida

22. Cromatograma, usando ECD, del análisis de clonazepam desde sangre post mortem (30 ng/mL) (tr 10.53) Clonazepam

23. COMENTARIOS Debido a la diversidad estructural de las 1,4 Benzodiazepinas es difícil una situación de rutina analítica, pues presentan diferentes respuestas (distintos niveles plasmáticos útiles, o por razones químicas o de sensibilidad). En los test de confirmación con extractos sin derivatizar por GC-MASS, no se observan peak para todas las muestras