Disciplina: Seminário I

2. UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ PROGRAMA DE DOUTORADO INTEGRADO EM ZOOTECNIA Disciplina: Seminário I Doutorando: Rodrigo Vasconcelos de Oliveira Orientador: PhD Arlindo de Alencar Araripe Moura Professor: Dr. Ednardo Rodrigues Freitas

3. UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ PROGRAMA DE DOUTORADO INTEGRADO EM ZOOTECNIA Abordagem Proteômica e a Identificação de Biomarcadores de Processos Fisiológicos Doutorando: Rodrigo Vasconcelos de Oliveira Orientador: PhD Arlindo de Alencar Araripe Moura Professor: Dr. Ednardo Rodrigues Freitas

4. INTRODUÇÃO Seres vivos Estrutural Enzimática Transporte Hormonal Proteínas Imunológica

5. INTRODUÇÃO Anderson & Anderson (1982) ATLAS DAS PROTEÍNAS HUMANAS

6. Proteômica ou Proteoma (Wasinger et al. 1995) A identificação e caracterização de proteínas, constituintes de uma matriz biológica (organismo, célula, organela, fluído biológico) que são produzidas em um determinado momento e sob determinadas condições.

7. Dinâmica do proteoma Fatores epigenéticos Temperatura Estresse Doenças Alimentação WITZMANN & LI (2002) DNA Transcrição pré-RNAm Splicing RNAm Modificações Tradução Degradações Proteínas

8. OBJETIVOS DO ESTUDO DA PROTEÔMICA Nível de expressão de proteínas Modificações Pós-traducionais Proteômica Interações entre proteínas Identificação de Biomarcadores

9. BIOMARCADORES São moléculas biológicas indicadoras de estados fisiológicos ou patológicos, passíveis de serem mensuradas em células e fluídos biológicos. Moore et al., (2007)

10. ABORDAGEM PROTEÔMICA E A IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES Coleta Coleta Amostra Separação Identificação ZHOU et al., (2005)

11. ABORDAGEM PROTEÔMICA E A IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES • Coleta de amostras: • Unicelulares (+ sincronização): • fase do ciclo celular e condições de cultivo • Células e Tecidos de Organismos Pluricelulares (- sincronização): • Biópsias: ≠ tipos celulares • Cultura de tecidos • Coleta: Manual X microdissecção a laser • Fluídos biológicos • Complexidade

12. ABORDAGEM PROTEÔMICA E A IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES • Eletroforese Bidimensional (2D) Espectrometria de Massa (EM) • Estudos fisiológicos ou patológicos comparativos; • Quantitativos • Qualitativos • Cromatografia líquida (CL) Espectrometria de massa (EM) • Recuperação de ptns na forma nativa • Análises funcionais, estruturais e bioquímicas

13. ELETROFORESE BIDIMENSIONAL • Separação de misturas proteícas com base em dois parâmetros físico-químicos: ponto isoelétrico (pI) e a massa molecular (M.M.), sob a influência de um campo elétrico: • 1ª Etapa: Focalização Isoelétrica • pI • 2ª Etapa: Eletroforese descontínua em gel de poliacrilamida + SDS (SDS-PAGE) • Tamanho (massa molecular) O’Farrell, 1975; Gorg et al. 1998

14. ELETROFORESE BIDIMENSIONAL (+) (maior) M.M. pI (menor) (-) Focalização Isoelétrica SDS-PAGE

15. ELETROFORESE BIDIMENSIONAL (maior) M.M. (menor) SDS-PAGE

16. ELETROFORESE BIDIMENSIONAL pI (-) (+) • Revelação • Azul brilhante de Coomassie coloidal • Fluorescência (+) M.M. Análise do gel (-)

17. ELETROFORESE BIDIMENSIONAL Gel A controle ≠ Gel B Tratamento ISSAQ & VEENSTRA (2008)

18. ELETROFORESE DE FLUORESCÊNCIA DIFERENCIAL EM GEL 2D (DIGE) Cy5 controle Cy5 Tratamento UNLU et al., (1997); ISSAQ & VEENSTRA(2008)

19. Tabela 1. Vantagens e limitações da eletroforese bidimensional.

20. ELETROFORESE BIDIMENSIONAL E ESPECTROMETRIA DE MASSA Digestão: tripsina Espectrômetro de massas m/z Programas: identificar a proteína Espectros de massas

21. ESPECTROMETRIA DE MASSAS Técnica analítica que identifica a composição química de compostos, pela determinação de suas massas moleculares na forma iônica, baseada na sua movimentação (m/z) através de um campo elétrico ou magnético. Fonte de Ionização Analisador Detector Amostra Dados Recipiente com baixa pressão

22. ESPECTROMETRIA DE MASSA • Ionização por dessorção a laser assistida por matriz -Tempo de vôo (MALDI-TOF) Tempo de vôo Detector amostra Laser Karas & Hillkamp (1998)

23. ESPECTROMETRIA DE MASSA m/z Espectros de massas peptídeos Espectrômetro de massa Impressão Digital de peptídeos Programas de Análise e pesquisa em banco de dados. Proteína Biomarcador

24. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE Método de separação física baseado na migração diferencial de compostos, devido a suas distintas interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel (bombeada sob pressão) e a fase estacionária (pequenas partículas). peptídeos

25. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE • Exclusão molecular • Poros com tamanhos controlados • Troca iônica • Altamente carregada (íons + ou -) • Fase líquida: • Solvente: alto grau de pureza • Fase estacionária: MATT et al. 2008

26. SISTEMA DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE Detector Bomba de alta pressão amostra Reservatório fase móvel Registro e análise dos dados coletor

27. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE • Métodos de detecção: • Absorbância (UV) • Fluorescência • Espectrometria de massa • CLEM proteínas

28. CROMATOGRAFIA ASSOCIADA A ESPECTROMETRIA DE MASSA EM TANDEM (ES/ES) • Ionização por spray de elétrons –Tempo de vôo em TANDEM (ESI-TOF/TOF) Camara de colisão m/z MATT et al., 2008

29. ESPECTROMETRIA DE MASSA (EM/EM) m/z Espectrômetro de massa (EM/EM) Espectros de massas Sequenciamento de novo da proteína Programas de Análise e pesquisa em banco de dados. Proteína Biomarcador

30. Tabela 1. Vantagens e limitações da cromatografia líquida de alta performance.

31. ABORDAGEM PROTEÔMICA E IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES Do geral para o particular Analisar proteomas de condições distintas e identificar as diferenças Do particular para o geral Analisar uma proteína e inferir suas funções no contexto do todo Separação de proteínas nas amostras Eletroforese bidimensional Cromatografia líquida (LC) fragmentação Espectrometria de Massas: Determinação de massas para identificação Impressão digital de peptídeos Sequenciamento de novo Bioinformática MANN et al. 2001 PROTEINA

32. Identificação da bactenecina no muco cervico-vaginal pela eletroforese-2D em um modelo ovino de trabalho de parto MS/MS Indução de parto Dexametasona (+) Bactenecina Trabalho de parto 0 h 28 h YOUNG et al. (2007)

33. Análise proteômica de proteínas hipotalâmicas de linhagens de galinhas de alta e baixa produção de ovos corte 18 semanas 60 semanas CLAP-MS/MS Ribonucleoproteína nuclear heterôgenea H3 (HNRPH3) poedeira (HNRPH3) (+) KUO et al. (2007)

34. Proteína Osteopontina como biomarcador de fertilidade em bovinos AIDA et al. (1999) Purificação Sequenciamento identificação Osteopontina Alta fertilidade 55 kDa; pI = 6,2 sêmen FIV Baixa fertilidade (+) oócitos KILLIAN et al. (1993) GONÇALVES et al. (2008)

35. Desafios na Abordagem Proteômica e Identificação Biomarcadores • Otimização dos bancos de dados • Detecção de proteínas em baixas concentrações; • Automatização das técnicas;

36. Perspectivas da abordagem proteômica e identificação de Biomarcadores • Diagnóstico e prognóstico de doenças e animais humanas e animais; • Seleção de animais de produção; • Descoberta de novos princípios da fisiologia celular; • “Metabolômica”;

37. Rodrigo V. De Oliveira oliveirarv@rocketmail.com