Introduzione ai trattamenti biologici: Cenni di microbiologia e cinetica biologica

1. Introduzione ai trattamenti biologici: Cenni di microbiologia e cinetica biologica Claudio Lubello Corso Ingegneria Sanitaria

2. I microrganismi

3. La suddivisione degli esseri viventi: classificazione filogenetica MACRORGANISMI Albero filogenetico della vita come definito dalla comparazione dell’RNA ribosomale. L’albero è costituito da tre domini degli organismi: Bacteria ed Archaea che hanno una cellula di tipo procariotico ed Eukarya, di tipo eucariotico. In rosso sono cerchiati i macrorganismi tutti gli altri sono quelli comunemente indicati come MICRORGANISMI.

4. Procarioti ed Eucarioti Eucariote: organismo costituito da cellule con nucleo ben differenziato e separato dal citoplasma per mezzo di una membrana nucleare. Procariote: organismo unicellulare il cui materiale cellulare non è racchiuso dentro una specifica membrana. Manca la suddivisione della funzione cellulare in specifici organuli.

5. Batteri I batteri sono organismi procarioti costituiti da una singola cellula. Le cellule batteriche si riproducono per scissione binaria. • I batteri possono essere di differente forma: • - SFERICA (Cocchi), • a BASTONCINO (Bacilli), • ELICOIDALE (Spirilli).   In genere le cellule batteriche sono lunghe da 1 a 10 micrometri (10-3mm) e hanno sviluppato gli adattamenti più svariati per ottenere energia e sostanze nutritive. Si trovano in quasi tutti gli ambienti: nell'aria, nel suolo, nell'acqua, nel ghiaccio, nelle sorgenti calde e perfino negli sbocchi idrotermali delle profondità oceaniche.

6. Composizione tipica dei batteri

7. Alghe verdi-azzurre Da non confondersi con le alghe. Sono cianobatteri ed appartengono al dominio dei BACTERIA. Sono organismi fotosintetici.

8. Alghe Rientrano fra le alghe numerosi organismi eucariotici che contengono clorofilla e svolgono la fotosintesi. La maggior parte sono microscopiche (quelle di nostro interesse), sono presenti tuttavia organismi macroscopici di dimensione molto elevata. Le alghe contengono clorofilla e si presentano di colore verde, possono assumere colori diversi (marrone o rosso) per la presenza di altri pigmenti. Colonie di Volvox

9. Protozoi I protozoi sono organismi eterotrofi generalmente unicellulari, sprovvisti di una ben delimitata parete cellulare. La maggior parte è mobile. Possono essere patogeni per l’uomo o per altri animali.

10. Funghi Sono organismi eterotrofi pluricellulari, caratterizzati dalla presenza di una parete cellulare e dalla produzione di spore. I gruppi di maggiore importanza sono: muffe, lieviti e funghi fruttiferi. Muffe: Sono funghi con struttura filamentosa, caratteristici per le loro efflorescenze polverose di colore bianco-grigio, verdastro, nero. Si riproducono tramite spore che differiscono nella morfologia, nel modo in cui sono prodotte, nel colore. Le loro condizioni ottimali di pH sono di circa 5,6 con intervallo tra 2 e 9. Lieviti: Funghi unicellulari che vivono in habitat liquidi o umidi.

11. Virus I virus non sono cellule ma particelle composte da acidi nucleici (DNA o RNA) racchiusi in un involucro proteico Il termine virus significa, “veleno” e venne usato per la prima volta per indicare particelle patogene più piccole dei batteri. Essi non possiedono molti degli attributi tipici delle cellule ed, in particolare, sono sistemi dinamici e aperti in grado di assimilare nutrienti ed espellere metaboliti. Sono parassiti intracellulari obbligati e solo quando infettano una cellula sono in grado di riprodursi.

12. Metabolismo microbico Percorsi metabolici e conseguente classificazione dei microrganismi

13. Il metabolismo dei microrganismi Un organismo per potersi riprodurre e funzionare correttamente ha bisogno di: • Energia • Carbonio • Elementi inorganici (nutrienti) • Fattori di crescita (amminoacidi, vitamine, basi azoto, …)

14. Anabolismo e Catabolismo Le attività metaboliche seguono due percorsi metabolici diversi: • cammino anabolico (consumo di energia), che è un processo assimilativo che comporta la sintesi dei componenti della cellula (biosintesi), • cammino catabolico (rilascio di energia), che è un processo dissimilativo. Le sostanze assunte vengono degradate attraverso una serie di passaggi intermedi fino a prodotti stabili. In questi passaggi si rende disponibile l’energia necessaria per la crescita e il mantenimento. I due processi si completano l’uno con l’altro.

15. Ossido riduzione Nei sistemi biologici la produzione e la conservazione dell’energia coinvolge reazioni di ossido-riduzione (redox).In queste si ha uno scambio di elettroni tra un elemento donatore che si ossida, ed un elemento accettore che si riduce. Le reazioni redox rispetto ad altre reazioni chimiche, hanno un valore più elevato della resa di energia per mole di reagenti coinvolti.

16. ATP ATP (Adenosintrifosfato):è la molecola che nel metabolismo delle cellule svolge l’importante funzione energetica di accumulare energia fornita dal catabolismo e di fornirla successivamente per le reazioni metaboliche, comportandosi come una sorta di batteria. L’ATP è costituito da un gruppo adenosina e tre gruppi fosfatici. Quando l’ATP perde un gruppo fosfatico, la rottura del legame rilascia una grande quantità di energia e si forma ADP (adenosindifosfato). ATP  ADP + Pi + energia Con un meccanismo di ricarica l’energia fornita dal catabolismo viene accumulata dalla reazione inversa. ADP + Pi + energia  ATP È opportuno evidenziare l’importanza del fosforo che deve essere sempre presente per garantire lo svolgimento delle reazioni metaboliche.

17. ATP

18. ATP Illustrazione schematica del ruolo svolto dall’ATP nel metabolismo

19. Schema del ruolo svolto dall’ATP nel metabolismo Reazioni Cataboliche Generazione di energia libera ATP SUBSTRATO (Fonte di Energia) Scambio di energia fosforilazione idrolisi ADP Reazioni Anaboliche Consumo di energia libera Prodotti metabolici Sintesi della biomassa Idrolisi ATP ATP+H2O ADP+Pi Fosforilazione ADP ADP+Pi ATP Metabolismo di mantenimento

20. Enzimie coenzimi Gli enzimi negli organismi viventi hanno il compito di velocizzare le reazioni biochimiche che, in loro assenza, avverrebbero tempi lunghi, non compatibili con il metabolismo cellulare. Alcuni enzimi per svolgere la loro attività hanno necessità di un composto addizionale, che può essere costituito da ioni inorganici o da molecole organiche dette coenzimi

21. Enzimi Cinetica enzimatica La velocità della reazione globale aumenta proporzionalmente alla concentrazione del substrato e quindi del complesso E-S. Come si può notare dalla figura, questo incremento decresce sino al raggiungimento di un plateau in cui la concentrazione di S è così elevata da mantenere sempre saturo l’enzima; in queste condizioni la velocità di reazione per unità di enzimi (o batteri), V/E, è massima e pari a k. La relazione tra concentrazione di substrato e la velocità è stata studiata da Michaelis- Menten

22. Nutrienti

23. Classificazione dei microrganismi I principali elementi che devono essere considerati per la classificazione dei microrganismi sono: SORGENTE DI CARBONIO:viene convertito in materiale cellulare (protoplasma) DONATORE DI ELETTRONI (SUBSTRATO):alimenta la semireazione di ossidazione e rappresenta la fonte di energia nel cammino catabolico. ACCETTORE DI ELETTRONI:alimenta la semireazione di riduzione nel cammino catabolico.

24. Fontedi Carbonio Eterotrofi: organismi che utilizzano come fonte il carbonio contenuto nei composti organici Autotrofi: organismi che utilizzano come fonte di carbonio la CO2

25. Energia Le cellule richiedono energia per le attività di sintesi e di mantenimento. L’energia può essere ottenuta da tre fonti diverse: I microrganismi che utilizzano la luce come sorgente di energia sono detti FOTOTROFI; quelli che invece usano l’energia chimica sono definiti CHEMIOTROFI. • Composti chimici organici • Composti chimici inorganici • Luce Chemiorganotrofi CHEMIOTROFI Chemiolitotrofi FOTOTROFI

26. Energia

27. Classificazione in funzione del ruolo dell’ossigeno I diversi tipi di metabolismo possono essere distinti sulla base delle modalità con le quali viene prodotta l’energia necessaria per le funzioni vitali. In particolare sulla necessità o meno dell’ossigeno come accettore finale delle reazioni di ossido-riduzione. Metabolismo aerobico quando l’ossigeno funge da accettore finale degli elettroni (i microrganismi che sfruttano questo metabolismo sono detti AEROBICI) Metabolismo anaerobico quando viene utilizzato un accettore finale di elettroni diverso dall’ossigeno (i microrganismi sono detti ANAEROBICI). Un caso particolare di metabolismo anaerobico è quello in cui gli accettori finali di elettroni siano i nitriti e/o i nitrati. Si parla in questo caso di Metabolismo anossico (spesso svolto da microrganismi FACOLTATIVI, che cioè in presenza di ossigeno usano questo come accettore ed in sua assenza nitriti e nitrati).

28. Respirazione e Fermentazione • Respirazione: ossigeno molecolare o altro composto inorganico come accettore di e-. Il substrato organico viene ossidato a CO2. • Fermentazione: assenza di un accettore di e- esterno. Vengono utilizzati gli stessi composti organici donatori. La fermentazione è caratterizzata in termini energetici da una resa inferiore alla respirazione (minore velocità di crescita ed inferiori rendimenti di sintesi)

29. - - e e Flussointernodi e- Fermentazione Respirazione Respirazione anaerobica anossica aerobica Trasformazionedel Carbonio C C C Substrato Substrato Substrato Prodotti di CO CO 2 2 organico organico organico fermentazione Accettore dielettroni - , - - , - - O N O S O C O 2 3 4 3 Ossido-Riduzioniinterne POTENZIALE REDOX molto negativo debolmente negativo positivo o circa zero Condizioni potenziale redox

30. Classificazione processi metabolici

31. Definizione dei parametri cinetici

32. Velocità e tasso di crescita Sia nei reattori batch, che in quelli a flusso continuo la velocità (rateo) di crescita dei batteri può essere definita dalla seguente relazione: in cui rg è la velocità di crescita batterica (massa/unità di volume x tempo) X è la concentrazione di microrganismi (massa/unità di volume)I Facendo riferimento al valore specifico (tasso) rispetto alla concentrazione X della biomassa si introduce il tasso di crescita:

33. Velocità e tasso di respirazione endogena L’attività di respirazione endogena corrisponde all’utilizzo come fonte di carbonio ed energia lo stesso materiale cellulare. Tale fase è sempre presente in contemporanea con la crescita cellulare. Diventa l’attività prevalente quando il substrato è esaurito. La velocità (rateo) di respirazione endogena dei batteri è definita dalla seguente reazione: in cui rd è la velocità di respirazione endogena (massa/unità di volume x tempo) Facendo riferimento al valore specifico (tasso) rispetto alla concentrazione X della biomassa si introduce il tasso di respirazione endogena:

34. Velocità di crescita netta La velocità di crescita netta è data dalla differenza fra quella di crescita e quella endogena (che comporta un consumo del materiale cellulare). r’g = rg - rd in cui rd è la velocità di respirazione endogena (massa/unità di volume x tempo) Facendo riferimento al valore specifico (tasso) rispetto alla concentrazione X della biomassa si introduce il tasso di crescita netta: ’ =  - kd

35. Velocità di utilizzazione del substrato La velocità di utilizzazione del substrato (termine con cui spesso si indica il donatore di elettroni) rappresenta la velocità con cui i batteri utilizzano il substrato: in cui rsu è la velocità di utilizzazione del substrato (massa/unità di volume x tempo) S è la concentrazione del substrato (massa/unità di volume) Facendo riferimento al valore specifico (tasso) rispetto alla concentrazione X della biomassa si introduce il tasso di utilizzazione del substrato:

36. Fattore di resa (rendimento di crescita) Una parte del substrato è convertito in prodotti inorganici ed organici finali mentre un’altra parte porta alla formazione di nuove cellule. La successiva relazione mette in relazione il tasso di utilizzazione del substrato (rsu massa/unità di volume x tempo) con rg il tasso di crescita batterico: In cui Y (massa/massa) è il fattore di resa. Tenendo conto che una parte del biomassa viene degradata a causa della respirazione endogena è utile introdurre il fattore di resa osservato Yobs:

37. Esempio di calcolo del fattore di resa Calcoliamo Y nel caso di un substrato noto (p.es. formaldeide CH2O) • Peso molecolare del substrato CH2O = 30 • Peso molecolare della biomassa C5H7NO2 = 113 Massa atomica C = 12 ; N = 14; H = 1; O = 16 Il fattore di resa può anche essere calcolato come: gCOD (nella biomassa prodotta) /gCOD (nel substrato degradato)

38. Calcolo di Y in termini di COD • Equivalenza COD/substrato: • Equivalenza COD/biomassa: • Pertanto Y:

39. Tasso di crescita e concentrazione del substrato Una relazione empirica della relazione esistente fra il tasso di crescita della biomassa e la concentrazione di substrato, largamente utilizzata nella pratica, è quella ricavata da Monod derivata dalla cinetica enzimatica di Michelis-Menten: Sostituendo questa espressione nella definizione del fattore di resa si ha: Dove k è il tasso massimo di utilizzazione del substrato, pari a μmax/Y. Ks rappresenta il valore della concentrazione del substrato al quale corrisponde un tasso di crescita pari alla metà del tasso massimo. Si noti che Per S>>Ks = max (cinetica di ordine zero) Per S<< Ks  = maxS/Ks (cinetica di ordine uno)

40. Proprietà della cinetica di crescita

41. Effetto della costante di semisaturazione KS = 10 KS = 50 KS = 100 All’aumentare del substrato disponibile il tasso di crescita aumenta fino ad un valore massimo. Si noti come in presenza di alti valori di Ks il rateo massimo di crescita si ottiene per valori più elevati dalla concentrazione del substrato, mentre con valori bassi di Ks si ottiene già con basse concentrazioni.

42. Sostanze inibitrici dei processi di crescita Oggi le acque reflue raccolgono spesso sostanze tossiche (composti organici o metalli pesanti) che possono diventare inibitori della crescita microbica impedendo così il funzionamento dei sistemi biologici di depurazione. Tale effetto di inibizione si esplica, solitamente, superando una definita soglia di concentrazione. Per esempio, nel caso di microrganismi eterotrofi, alcune soglie sono riportate di seguito: Arsenico 0.05 mg/l; Cadmio 1 mg/l; Cromo tot. 10 mg/l; Cromo esa. 1 mg/l; Rame 1 mg/l, Piombo 0.1 mg/l; Mercurio 0.1 mg/l; Nickel 1 mg/l; Zinco 1 mg/l. Nel caso di microrganismi autotrofi nitrificanti le soglie sono inferiori.