1 / 12

Rakuvaba valgusüntees

Rakuvaba valgusüntees. Radioaktiivsete aminohapete lülitamine valkudesse peale rakkude lõhkumist 50. Aastatel (F. Lipmann, P. Zamecnick). Enne kui sai selgeks, mis komponendid rakus valku sünteesivad. Enne DNA ja RNA rakuvaba sünteesi. Valgusüntees rakuekstraktides I S30 bakterist.

rianna
Download Presentation

Rakuvaba valgusüntees

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Rakuvaba valgusüntees • Radioaktiivsete aminohapete lülitamine valkudesse peale rakkude lõhkumist 50. Aastatel (F. Lipmann, P. Zamecnick). • Enne kui sai selgeks, mis komponendid rakus valku sünteesivad. • Enne DNA ja RNA rakuvaba sünteesi

  2. Valgusüntees rakuekstraktides IS30 bakterist • Rakud lüüsitakse DNaasi juuresolekul, tsentrifuugitakse ja dialüüsitakse. • Lisatakse: • mRNA • Aminohapped • ATP, GTP ja energia regeneratsiooni süsteem (PEP/PK, AcP/AK, KrP/KP) • SH reagent (DTT, 2-ME), Mg2+, K+ või NH4+

  3. Valgusüntees rakuekstraktides IIeukarüootsed ekstraktid • Küüliku retikulotsüütide lüsaat valmistatakse aneemilistest küülikutest ja dialüüsitakse • Lisatakse aminohapped, ATP, GTP, energia regenratsioonisüsteem • Sünteesib põhiliselt -globiini

  4. Valgusüntees rakuekstraktides IIeukarüootsed ekstraktid • Töödeldes retikulotsüütide lüsaati Ca2+ sõltuva nukleaasiga (Micrococcuse nukleaas) saab vabaneda endogeensest mRNA’st ja EGTA lisamisega lüsaat uuesti aktiivseks muuta. • Sarnaseid süsteeme tehakse ka nisuidudest, pärmist ja platsentast

  5. Fraktsioneeritud süsteemid • Bakteriaalsed ribosoomid • mRNA, tRNA • S-100 valgufraktsioon • Foolhape (tetrahüdrofolaat) • aminohapped • ATP, GTP, energia regeneratsioon • SH reagent, Mg2+, K+ või NH4+

  6. DNA suunatud valgusüntees(transkriptsioon/translatsioon seotud süsteem) • Seda süsteemi saab teha nii S30 kui fraktsioneeritud süsteemi baasil • S30 puhul võib kasutada endogeenset RNA polümeraasi. • Süsteem sisaldab lisaks eelnevale ka UTP, CTP, DNA matriitsi ja vajadusel sobivat RNA polümeraasi (T7, T5, SP6)

  7. Puhastatud valgusünteesi süsteem • Puhtad 70S ribosoomid • mRNA, tRNA • Formüül-tetrahüdrofolaat, transformülaas • IF-1, IF-2, IF-3/ EF1A, EF-1B, EF-2, RF-1, RF-2, RF-3, RRF • Kõik AARS’d, aminohapped • ATP, GTP, PEP/PK • Ka seda süsteemi on võimalik teha DNA sõltuvaks

  8. aatRNA sõltuv valgusünteesi süsteem • Puhtad ribosoomid • Aa-tRNA (üks või mitu või kõik) NB! aa-tRNA on väga labiilne, FMet-tRNA ja NAc-aa-tRNA’d on stabiilsemad • mRNA (siin kasutatakse palju hompolümeere ja ühe koodoni kordusi, näiteks polü(U)) • Elongatsioonifaktorid, energia, ioonid

  9. Eripärased osasüsteemid • Faktorvaba translatsioon töötab väga väikese efektiivsusega vaid polü(U) translatsioonil • Matriitsivaba translatsioon on võimalik vaid väheste tRNA’de puhul (Lys, Thr, Ser, Asp), mis on tRNA, mitte aga aminohappe omadus

  10. Milleks seda kõike vaja on? • Valkude ekspressioon rakuvabas süsteemis: • Valgud, mida on raske ekspresseerida in vivo (tsütotoksilised, ebastabiilsed) • Valkude märkimine stabiilsete või radioaktiivsete isotoopidega, spin märke või fotoaktiveeritava rühmaga • Geneetilise koodi laiendamine • In vitro evolutsioonilised lähenemised

  11. Pidev translatsioon stabiilses süsteemis • Läbivoolu süsteemis, kus põhiliselt kasutatakse kas bakteri S30 ekstrakti või küüliku retikulotsüüdi lüsaati, mida “toidetakse” NTP, energia ja aminohapetega • DNA suunatud süsteem on stabiilne kuni 60 tundi, saagis võib ulatuda 300 g/ml • Oluline on produkti eemaldamine kas membraani või afiinsus-sorbendi abil • Produkt eraldub koos läbivooluga kiirusega 1 ml/min. 1 ml reaktsiooni kohta • Parimal juhul on valgu hind odavam kui in vivo ekspressioonil

  12. Geneetilise koodi laiendamine • Kunstlike aminohapete (või ka hüdroksühapete) lülitamine valkudesse koht-spetsiifiliselt • Kasutatakse optimiseeritud suppressor-tRNA’d (UAG), mis sünteesitakse in vitro ilma viimase kahe nukleotiidita (-CA) • Sünteesitakse keemiliselt CA(3’O)-derivaat, mis ligeeritakse “lühikese” tRNA otsa, tulemuseks on kunstlik aa-tRNA • Kuigi erinevate derivaatide lülitumine valkudesse toimub erineval tasemel (saagis ulatub 70%-ni), on sellisel meetodil lülitatud valkudesse >50 erineva kunstliku aminohappe. • Uute ensüümide disain ja olemasolevate ensüümide ratsionaalne parandamine

More Related