Bioķīmija I

1. Bioķīmija I

2. Kas ir bioķīmija? • Bioķīmija ir zinātne par molekulām un ķīmiskajiem procesiem dzīvos organismos • Molekulārā bioloģija pēta procesus, kuri gēnos iekodēto informāciju izmanto organisma funkciju nodrošināšanai – replikāciju, transkripciju un translāciju • Robeža starp bioķīmiju un molekulāro bioloģiju nav stingri definēta

3. Bioķīmijas, ģenētikas un molekulārās bioloģijas radniecība Funkcija Bioķīmija Ģenētika Proteīni Gēni Molekulārā bioloģija

4. Kursa saturs • 20 lekcijas (beigsies 6. novembrī) • Aptuveni 15 pārbaudes darbiņi (15 min lekciju sākumā par iepriekšējās lekcijas saturu) • 4 laboratorijas darbi (sāksies 1. oktobrī) • Eksāmens Kursa vadītājs K. Tārs, kaspars@biomed.lu.lv, tel. 27076237

5. Laboratorijas darbi • Vadītājs – doc. N. Līcis (licis@biomed.lu.lv) • 1. Laktātdehidrogenāzes reakcijas kinētika. • Enzimātisko reakciju kinētikas parametru un inhibitora ietekmes noteikšana. • 2. Asins seruma proteīnu sadalīšana ar elektroforēzi. • Asins seruma proteīnu sastāva analīze. • 3. Aminoskābju titrēšana. • Aminoskābju skābju-bāžu īpašības. • 4. Seminārs – laboratorijas darbu protokolu ieskaite.

6. Lekciju saturs • 1. daļa – Strukturālā bioķīmija (K. Tārs): • ievads, aminoskābes, proteīnu struktūra un funkcija, enzīmi, nukleīnskābes, ogļhidrāti, lipīdi, membrānas • 2. daļa – Bioenerģētika un metabolisms • ievads, glikolīze, glikoneoģenēze, Krebsa cikls, taukskābju katabolisms, aminoskābju oksidēšana, oksidatīvā fosforilēšana, lipīdu biosintēze, aminoskābju biosintēze, nukleotīdu biosintēze, hormoni, DNS, RNS un proteīnu biosintēze (U. Kalnenieks, K. Tārs)

7. Mācību grāmata • Lehninger Principles of Biochemistry 6th edition. David L. Nelson, Michael M. Cox. W.H. Freeman and company, New York • Aptuveni tas pats saturs ir arī iepriekšējos (4. un 5.) izdevumos 4. izdevums 5. izdevums 6. izdevums

8. Studiju materiāli • Atrodami «Grozā», molekularās bioloģijas katedras sadaļā • Turpat būs pieejami arī vērtējumi

9. Prasības • Sekmīgi nokārtoti visi pārbaudes darbiņi • Apmeklēti visi laboratorijas darbi, par kuriem vēlāk iesniegti protokoli • Sekmīgi nokārtots eksāmens • Kavētos pārbaudes darbiņus var uzrakstīt pēc lekcijas 331. telpā • Galīgajā atzīmē 50% sastāda pārbaudes darbiņu vidējā atzīme un 50% eksāmena atzīme • Sekmīgi nokārtoto pārbaudes darbiņu pārlikšana nolūkā iegūt augstāku atzīmi netiks atbalstīta

10. Instrumentālās metodes • Kurss sāksies 5. septembrī • Kura mērķis - iepazīstināt studentus ar dažādām instrumentālām metodēm ar pielietojumu molekulārajā un šūnu bioloģijā, bioķīmijā un citās radniecīgās nozarēs • Kurss notiks LU BF un Biomedicīnas pētījumu un studiju centrā (BMC)

11. Instrumentālo metožu kursa saturs • Proteīnu ekspresija, attīrīšana un elektroforēze (BF, 2xlekc., lab. d.) • Mikroskopija - optiskā (BF), konfokālā (BF), elektronu (BMC), lekc., lab.d., demonstr. • Organellu atdalīšana centrifūgas gradientā (BF, lekc.+lab.d) • DNS sekvenēšana (BMC, lekc. +demonstr.) • Masspektrometrija (BMC, lekc. + mini-lab.d.) • Reālā laika PCR (BMC, lekc. + demonstr.) • Plūsmas citometrija (BMC, lekc. + mini-lab.d.) • Radioaktivitātes pielietojums bioloģijā (BMC, lekc. + mini lab.d) • Proteīnu struktūru noteikšanas metodes – rentgenstruktūranalīze un KMR (BMC, BF 2xlekc., 1xmini lab.d.)

12. 1. lekcija Aminoskābes, peptīdi, proteīnu struktūra

13. Aminoskābes • Organiski savienojumi ar amino- un karboksil- grupām • Proteīni sastāv no 20 dažādām aminoskābēm ar vienādu skeletu (“backbone”), bet atšķirīgām sānu ķēdēm (“R”) • Visas proteīnus veidojošās aminoskābes ir a-aminoskābes • T.i. karboksil- un amino- grupas ir pievienotas pie viena un tā paša oglekļa atoma, saukta par Ca COO- | COO- | COO- | H3+N―Ca―Cb―H H3+N―Ca―H H3+N―Ca―Cb―Cg―H | R | R | | R’ R’’ | R’ | R a-aminoskābe b- un g- aminoskābes (proteīnus neveido)

14. Aminoskābju optiskie izomēri • Visu aminoskābju (izņemot glicīnu) a-ogleklim ir 4 dažādi aizvietotāji, tāpēc ir iespējami 2 optiskie izomēri – D un L. • Proteīnos sastopamās aminoskābes ir L- aminoskābes • DL nomenklatūra ir aizgūta no gliceraldehīda

15. Aminoskābes ar diviem optiskajiem centriem • Treonīnam un izoleicīnam ir divi optiskie centri • Proteīnos vienmēr ir sastopams tikai viens no 2 vai 4 iespējamajiem optiskajiem izomēriem L-treonīns (sastopams dabā) D-treonīns D-allo-treonīns L-allo-treonīns

16. Aminoskābju klasifikācija • Parasti aminoskābes klasificē pēc to sānu ķēžu polaritātes • Izdala nepolārās (hidrofobās), polārās un lādētās aminoskābes

17. Nepolārās (hidrofobās) aminoskābes • Sānu ķēde satur nepolāras, hidrofobas oglekļa virknes. Nepolārās aminoskābes (izņemot glicīnu) slikti šķīst ūdenī. Glicīns Alanīns Valīns Leicīns Izoleicīns (G, gly) (A, ala) (V, val) (L, leu) (I, ile) Glicīnam nav sānu ķēdes un to bieži klasificē atsevišķi. Vienīgā aminoskābe, kurai nav optisko izomēru Leicīns un izoleicīns ir strukturālie izomēri

18. Nepolārās (hidrofobās) aminoskābes Metionīns Fenilalanīns Triptofāns Prolīns (M, met) (F, phe) (W, trp) (P, pro) Prolīnasānu ķēdeir piesaistīta aminogrupai, veidojot ciklu Metionīns satur sēra atomu Fenilalanīns un triptofāns satur plakanus aromātiskos gredzenus Triptofānu, tā NH grupas dēļ dažreiz klasificē kā polāru, bet praksē tam ir izteiktākas nepolārās īpašības

19. Polārās aminoskābes • Sānu ķēde sastāv no oglekļa, skābekļa, un slāpekļa atomiem • O un N atomi sānu ķēdi padara polārāku un tādejādi hidrofilāku • Polārās aminoskābes labi šķīst ūdenī. Serīns Treonīns Cisteīns Tirozīns Aspargīns Glutamīns (S, ser) (T, thr) (C, cys) (Y, tyr) (N, asn) (Q, gln) Cisteīnam ir gan polāras, gan hidrofobas īpašības. Divi cisteīni var savienoties ar SH grupām

20. Lādētās aminoskābes - Sānu ķēdei ir lādiņš piefizioloģiska pH Aspargīnskābe Glutamīnskābe Lizīns Arginīns Histidīns (D, asp) (E, glu) (K, lys) (R, arg) (H, his) Pie fizioloģiski relevantām pH vērtībām histidīns var būt gan lādēts (pH<6), gan polārs (pH>6) . Bieži klasificē kā polāru aminoskābi

21. Aminoskābju burtu kodi • Aminoskābju un to secības pierakstam lieto saīsinātus apzīmējumus • Izplatīti ir gan trīsburtu, gan vienburta kodi • Peptīda pieraksta piemērs: • Alanīns-glicīns-leicīns-triptofāns-metionīns • Ala-Gly-Leu-Trp-Met • AGLWM

22. Kā atcerēties aminoskābju kodus?

23. Kā atcerēties aminoskābju kodus?

24. Kā atcerēties aminoskābju kodus?

25. Cisteīns un disulfīdi • Vienīgais universālais veids, kā kovalenti savienot divas aminoskābes, kuras sekvencē nav blakus viena otrai, ir ar disulfīdu tiltiņu palīdzību • Disulfīdu veidošanai ir nepieciešama oksidējoša vide. Tā kā šūnas iekšienē vide ir reducējoša, disulfīdi ir reti sastopami iekššūnas proteīnos, bet bieži sastopami šūnas virsmas un sekretējamos proteīnos oksidēšanās reducēšanās Cisteīns Cistīns

26. Neparastās aminoskābes • Dzīvajos organismos ir konstatētas aptuveni 300 dažādas aminoskābes, bet lielākā daļa no tām nav proteīnu sastāvā • Ornitīns un citrullīns ir nozīmīgi starpprodukti aminoskābju metabolismā • Proteīnu sastāvā esošās aminoskābes var tikt modificētas – piem. hidroksilprolīns (Hyp) un hidroksillizīns (Hyl) kollagēnā Citrullīns Ornitīns

27. Selenocisteīns (U, Sec) • Līdzīgs cisteīnam, bet ar selēnu sēra vietā • Atrodams t.s. selenoproteīnu sastāvā – parasti enzīmu aktīvajā centrā • Cilvēkiem konstatēts 25 proteīnos • Atšķirībā no modificētajām aminoskābēm, Sec tiek inkorporēts proteīnu sastāvā translācijas laikā ar īpaša ģenētiskā koda palīdzību, tādēļ Sec klasificē kā proteinogēno aminoskābi • Tādejādi, eikariotiem ir 21 proteinogēnās aminoskābes – 20 standarta plus Sec

28. Aminoskābes kā cviterjoni • Pie fizioloģiska pH aminoskābes pastāv galvenokārt bipolāru jonu – cviterjonu veidā Cviterjona forma Nejonizētā forma

29. Aminoskābes kā skābes un bāzes • Aminoskābju sastāvā ir skāba karboksilgrupa un bāziska aminogrupa • Aminoskābes var protonu gan donēt, gan akceptēt Cviterjons kā bāze Cviterjons kā skābe

30. Peptīds • Peptīds ir kovalenti saistītu aminoskābju kopums • Peptīda saite veidojas, vienas aminoskābes aminogrupai reaģējot ar otras aminoskābes karboksilgrupu • Aminoskābes peptīda sastāvā mēdz saukt par atlikumiem • Izveidotā peptīda saite ir daļēji dubulta Peptīda saite Peptīdiem ir N-gals un C-gals N-gals C-gals

31. Galvenā ķēde un sānu ķēdes Katram polipeptīdam ir viena galvenā ķēde un tik sānu ķēdes, no cik aminoskābēm peptīds sastāv

32. Atomu nomenklatūra aminoskābes atlikumā • Galvenās ķēdes atomi ir N, Ca, C un O • Sānu ķēdes atomi tiek saukti pēc grieķu alfabēta, sākot no Cb • Sānu ķēdes sazarošanās gadījumā ir papildus indeksi “1” un “2” “O” “N” “Ca” “Cb” “C” “Cg” “Cd” “Ne” “Nh2” “Cz” “Nh1”

33. Peptīdu torsijas leņķi N • phi (f) leņķis N-Ca • psi (y) leņķis Ca-CO • omega (w) leņkis C-N

34. w leņkis, cis- un trans- peptīdi • Tā kā peptīda saite ir daļēji dubulta, leņķis ir tuvu 180otrans- peptīdiem vai 0ocis- peptīdiem (±30o ekstremālos gadījumos) • Cis- peptīdi ir enerģētiski ļoti neizdevīgi (~1000 reizes salīdzinot ar trans-), jo blakus esošie Ca atomi ir pārāk tuvu viens otram Ca Ca Ca Ca

35. Prolīnu cis-trans izomerizācija • Cis- peptīda saite pirms prolīna ir tikai 4x neizdevīgāka par trans- saiti, jo tuvu blakus sanāk vai nu abi Ca atomi vai Ca un Cd atomi • Prolīna cis-trans izomerizācija ir svarīgs faktors proteīnu foldingā un reakciju katalizē īpaši enzīmi – prolilpeptidil izomerāzes (Ppāzes). • Aptuveni 0.03% no ne-prolīna un 5.2% no x-Pro peptīdiem proteīnos ir cis- konformācijā • Cis- peptīdiem proteīnos bieži ir nozīmīga funkcija Ca Ca Ca x-x Ca Ca Cd Ca Ca x-pro Ca Cd Trans- Cis-

36. Galvenās ķēdes konformācijas • Tikai noteiktasyunfleņķukombinācijas ir enerģētiski izdevīgas, jo citādi sānu ķēdes pirmais atoms (Cb) novietojas pārāk tuvu galvenās ķēdes atomiem vai arī pārāk tuvu novietojas blakus esošo aminoskābju skābekļa atomi • Tā kā glicīnam nav sānu ķēdes, tam ir atļautas daudz vairākas yunfleņķukombinācijas. Tādejādi, glicīns ir īpaša un strukturāli nozīmīga aminoskābe, pārsvarā sastopams fleksiblos proteīnu rajonos Neatļautās konformācijas nav fiziski neiespējamas, bet enerģētiski neizdevīgas

37. yunfleņķukombinācijas var attēlot Ramačandrāna plotā Visizdevīgākās konformācijas (90% aminoskābju) Atļautās konformācijas (8%) Neatļautās konformācijas (<2%) Neatļauto konformāciju aminoskābēm bieži ir liela nozīme proteīnu funkcinalitātē

38. Aminoskābju statistiskais sadalījums zināmās struktūrās Non-Gly, non-Pro Gly Pro

39. Sānu ķēžu konformācijas Ne-zigzagveida zigzagveida • Sānu ķēdēm (izņemot alanīnu un glicīnu) var būt dažādas konformācijas • Dažām konformācijām ir zemāka enerģija – tos sauc par rotamēriem • Zemāka enerģija ir t.s. zigzagveida izvietojumā – kad visi atomi ir maksimāli tālu viens no otra Trīs iespējamie valīna rotamēri

40. Nosauciet trīs aminoskābes, kuras ir ļoti atšķirīgas no citām! Prolīns • Nav brīvas aminogrupas • Ļoti stingrs • Ievieš pārrāvumus vai izliekumus a spirālēs un b virknēs Glicīns • Nav sānu ķēdes • Var atrasties daudzās vietās Ramačandrāna plotā • Proteīnos bieži sastopams fleksiblos reģionos Cisteīns • Disulfīdi

41. Pirmējā (primārā), otrējā (sekundārā), trešējā (terciārā) un ceturtējā (kvartārā) struktūra

42. Otrējā struktūra • Izšķir divus galvenos otrējo struktūru veidus – alfa spirāles un beta virknes • Alfa spirāles var pastāvēt atsevišķi, bet beta virknes grupējas kopā vismaz pa divām vai vairākām, veidojot beta plāksnes • Alfa spirāles shematiski attēlo kā spirāles vai cilindrus • Beta virknes shematiski attēlo kā bultas virzienā no N uz C galu • Otrējā struktūrā aminoskābju galvenās ķēdes skābekļa un slāpekļa atomi viens ar otru mijiedarbojas ar ūdeņraža saišu palīdzību

43. Alfa spirāle • Labās vītnes spirāle • 3.6 atlikumi vienā pagriezienā • Ūdeņraža saites ir starp atlikuma n N atomu un atlikuma n+4 O atomu n+4 n n+4 n 3.6 aminoskābes

44. Shematisks reālas a-spirāles attēlojums C-gals C C C N N N N -gals Pievienota shematiska spirāle. Var redzēt, ka sānu ķēdes virzās slīpi uz leju kā egles zari Parādītas tikai saites starp atomiem Parādītas arī H saites starp n un n+4 atlikumiem

45. Alfa spirāles galvenās ķēdes ģeometrija • Ģeometriski ideālai α spirālei phi/psi leņķu kombinācija ir -57.8, -47.0 • Realitātē vidējās vērtības ir -64 +/- 7, -41 +/- 7 Borēlijas virsmas proteīns BBA64 sastāv tikai no α spirālēm un dažām cilpām. Redzams, ka Ramačandrāna plotā lielākā daļa aminoskābju ir t.s. α rajonā.

46. Beta plāksnes • Sastāv no vismaz 2 b-virknēm • Atšķirībā no a-spirālēm, H saites ir starp divām dažādām virknēm • b-virknēs polipeptīds ir izstieptā konformācijā Plāksne no antiparalēlām b-virknēm Plāksne no paralēlām b-virknēm

47. Jauktās b plāksnes Jauktās b plāksnes ir daudz retāk sastopamas kā antiparalēlās vai paralēlās

48. Beta virknes galvenās ķēdes ģeometrija • Ģeometriski ideālai β virknei phi/psi leņķu kombinācija ir -120, 120 Antivielu Fab fragments sastāv pārsvarā no β virknēm. Redzams, ka Ramačandrāna plotā lielākā daļa aminoskābju ir t.s. β rajonā.

49. Reversie pagriezieni • 2-6 aminoskābju gari fragmenti, kas kalpo, lai pagrieztu polipeptīdu ķēdi pretējā virzienā • Eksistē daudzi pagriezienu tipi un apakštipi • Veidojas 1 H-saite, starp atlikumiem i un i+n, n=1...5 • Tipiskākie ir β-pagriezieni, H saite starp i un i+3. Eksistē 9 β-pagriezienu apakštipi, kuri atšķiras ar aminoskābju phi/psi leņkiem • Citi tipi: α: i→i+4, γ: i→i+2, δ: i→i+1, π: i→i+5 • Dažu apakštipu pagriezieniem ir tādas phi/psi kombinācijas, ka nepieciešams viens vai divi glicīni Jābūt glicīnam I, I’, II un II’ tipu beta pagriezieni

50. Cilpas • Cilpas savieno otrējās struktūras elementus • Cilpas atrodas uz proteīna virsmas • Atšķirībā no reversajiem pagriezieniem, galvenās ķēdes slāpekļa un skābekļa atomi parasti cilpās neveido H-saites viens ar otru • Cilpās ir daudz polāro un lādēto aminoskābju, arī glicīnu • Cilpu garums var būt no 2 līdz 20 atlikumiem • Cilpas ir fleksiblas • Cilpas bieži veido ligandu piesaistes vietas un enzīmu aktīvos centrus • Homologos proteīnos cilpu rajoni ir daudz variablāki nekā sekundāro struktūru rajoni