ENZYMATYCZNA SYNTEZA KWASU FENYLOPIROGRONOWEGO SELEKTYWNIE ZNAKOWANEGO IZOTOPAMI WODORU.

1. H2O D2O Vmax(śr.) 6,55*102 3,92*102 Km(śr.) 1,23*101 1,41*101 Ilona Ziąbska [3(S)-D(T)]-L-fenyloalanina WSTĘP I ZAŁOŻENIA PRACY Kwas fenylopirogronowy jest metabolitem fenyloalaniny, który pojawia się we krwi u chorych na fenyloketonurię. Fenyloketonuria to genetycznie uwarunkowana choroba metaboliczna. Polega na uszkodzeniu genu kodującego hydroksylazę fenyloalaninową, enzymu, który bierze udział w metaboliźmie fenyloalaniny. Defekt tego enzymu powoduje, że na etapie przekształcania fenyloalaniny w tyrozynę (prekursora hormonów, barwników) pojawia się blokada i fenyloalanina gromadzi się we krwi. Nadmierne jej stężenie, a tym samym jej pochodnych, czyli głównie kwasu fenylopirogronowego, jest przyczyną upośledzenia rozwoju fizycznego i intelektualnego. ENZYMATYCZNA SYNTEZA KWASU FENYLOPIROGRONOWEGO SELEKTYWNIE ZNAKOWANEGO IZOTOPAMIWODORU. Celem mojej pracy magisterskiej było opracowanie metody syntezy kwasu fenylopirogronowego znakowanego izotopami wodoru w pozycji trzeciej. Wykorzystałam reakcję oksydacyjnej deaminacji L-fenyloalaniny katalizowaną przez enzym dehydrogenazę fenyloalaninową (PheDH, Phenylalanine Dehydrogenase, EC 1.4.1.20). SYNTEZA [3(S)-D(T)]-L-FENYLOALANINY Substratem do syntezy znakowanego kwasu fenylopirogronowego była znakowanaL-fenyloalanina, którą otrzymałam w wyniku enzymatycznej addycji amoniaku do kwasu E-cynamonowego. Zastosowałam w niej bufor amonowy, wzbogacony wodą deuterowo-trytową, jednocześnie jako źródło amoniaku, izotopów wodoru oraz medium reakcji. BADANIA KINETYCZNE Spektrofotometryczna kontrola przebiegu reakcji oksydacyjnej deaminacji L-fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego pozwoliła na wyznaczenie kinetycznych parametrów tej reakcji, czyli szybkości maksymalnej (Vmax) oraz stałej Michaelisa (Km). Porównanie tych wielkości wyznaczonych z przebiegu reakcji w buforze sporządzonym na bazie H2O oraz na bazie D2O, daje możliwość wyznaczenia rozpuszczalnikowego efektu izotopowego (SIE). Wykonałam serie pomiarów dla obydwu rozpuszczalników, po uśrednieniu wyników wyliczyłam stosunek (k) Vmax(śr.) do Km(śr.) w H2O do Vmax(śr.)do Km(śr.)w D2O. k=1,91 Wynik ten wskazuje jednoznacznie, że rozpuszczalnikowy efekt izotopowy rzeczywiście występuje. Praca magisterska wykonana w Pracowni Peptydów Wydziału Chemii UW Promotor pracy:prof. dr hab. Marianna Kańska Opiekun pracy: mgr Katarzyna Skowera kwas E-cynamonowy Rys.4. Schemat reakcji addycji amoniaku do kwasu E-cynamonowego. Enzymem katalizującym tę reakcję jest liaza fenyloalaninowa (PAL, Phenylalanine Ammonia Lyase EC 4.3.1.5). Jest to enzym powszechnie występujący w roślinach wyższych oraz niektórych gatunkach grzybów. W reakcji addycji amoniaku do kwasu E-cynamonowwego, PAL przyłącza wodór ze środowiska do trzeciego atomu węgla w pozycji pro-S, natomiast wodór w pozycji 3-pro-R pochodzi od kwasu cynamonowego. Tab.1. Parametry kinetyczne reakcji L-fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego. Rys.5. Model liazy fenyloalaninowej (PAL). Rys.1. Schemat przedstawiający metabolizm fenyloalaniny. SYNTEZA [3(S)-D(T)]-KWASU FENYLOPIROGRONOWEGO Do syntezy znakowanego kwasu fenylopirogronowego wykorzystałam reakcję oksydacyjnej deaminacji znakowanej L-fenyloalaniny. Rys.8. Wykres przedstawiający przebieg reakcji L-fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego w H2O. Rys.9. Wykres przedstawiający przebieg reakcji L-fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego w D2O. [3(S)-D(T)]-L-fenyloalanina [3(S)-D(T)]-kwas fenylopirogronowy L-fenyloalanina kwas fenylopirogronowy Rys.6. Schemat oksydacyjnej deaminacji L-fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego. Rys.2. Reakcja oksydacyjnej deaminacji L-fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego. Reakcję tę katalizuje dehydrogenaza fenyloalaninowa (PheDH, Phenylalanine Dehydrogenase EC 1.4.1.20). Enzym ten należy do klasy oksyreduktaz. Charakteryzuje się wysoką specyficznością w stosunku do fenyloalaniny, a także do tyrozyny. Katalizuje również reakcję odwrotną. Otrzymany kwas fenylopirogronowy redukuje się enzymatycznie do kwasu fenylomlekowego przy udziale dehydrogenazy mleczanowej (LDH, Lactic Dehydrogenase EC 1.1.1.27). BIBLIOGRAFIA 1. W. Hummel, H. Schutte, M.R. Kula, Anal. Biochem., 1988, 170, 397-401. 2. I. Følling, Acta Pædiatr., 1994, Suppl. 407, 4-10. 3. W. Hummel, N. Weiss, M.R. Kula, Arch. Microbiol., 1984, 137, 47-52. 4. Y. Asano, A. Nakazawa, K. Endo, J. Biol. Chem., 1987, 262, 10346-10354. 5. J.L. Vanhooke, J.B. Thoden, N.M. Brunhuber, J.S. Blanchard, H.M. Holden, Biochemistry, 1999, 38, 2326-2339. 6. K. Kataoka, K. Tanizawa, T. Fukui, H. Ueno, T. Yoshimura, N. Esaki, K. Soda, J. Biochem, 1994, 116, 1370-1376. 7. K.C. Dooley, Clin. Biochem., 1992, 25, 271-275. 8. M.A. Vilaseca, C. Ferré, F. Ramón, Clin. Chem., 1993, 39, 129-131. 9. L.R. Feksa, A.R. Cornelio, C.S. Dutra-Filho, A.T. de Souza Wyse, M. Wajner, C.M. Duval Wannmacher, Brain Research, 2003, 968, 199-205. 10. P.W.K. Wang, M.E. O’Flynn, T. Inouye, Clin. Chem., 1964, 10, 1098-1105. 11. J. Oberdoerster, M. Guizzetti, L.G. Costa, J. Pharmacol. Experiment. Therapeut., 2000,295, 295-301. kwas fenylomlekowy kwas fenylopirogronowy Rys.3. Reakcja redukcji kwasu fenylopirogronowego do kwasu fenylomlekowego. Rys.7. Model dehydrogenazy fenyloalaninowej (PheDH). Mechanizmy reakcji katalizowanych przez dehydrogenazę fenyloalaninową i dehydrogenazę mleczanową nie zostały jeszcze do końca poznane. Ich wyjaśnienie jest możliwe dzięki zastosowaniu metod izotopowych, a w szczególności metody kinetycznych efektów izotopowych (KEI). Aby móc ją zastosować, potrzebne są związki znakowane i dlatego w ramach mojej pracy magisterskiej postanowiłam zająć się ich syntezą. Kofaktorem dla dehydrogenazy fenyloalaninowej jest utleniona forma NAD+, która podczas reakcji ulega redukcji, dając NADH. NADH wykazuje maksimum absorpcji przy 340 nm, dzięki temu przebieg reakcji można kontrolować spektrofotometrycznie.