Obligát anaerob mikroorganizmusok felszaporítása

1. Obligát anaerob mikroorganizmusok felszaporítása

2. Obligát anaerob mikroorganizmusok Obligát anaerobnak nevezünk egy mikroorganizmust, ha az csak anaerob viszonyok között képes létezni. Abból adódik az obligát jellege, hogy nem rendelkezik kataláz enzimmel. A kataláz enzim segítségével bontaná az oxigén jelenlétében keletkező peroxidot, ami méreg számára. 2O2- + 2H+ szuperoxid dizmutáz  H2O2 + O2 H2O2 kataláz  H2O + ½ O2 E két jellemző reakció hiányzik az obligát anaerob mikroorganizmusok esetén.

3. Obligát anaerob mikroorganizmusok fontossága A kizárólag anaerob mikroorganizmusok a talaj alsóbb oxigénhiányos rétegeiben helyezkednek el az aerob és a fakultatív anaerob életterek alatt. Életfunkcióik fenntartásához anaerob oxidációval nyernek energiát. Ez többféle vegyület jelenlétében lehetséges. Ezek szerint beszélünk nitrátlégzésről, szulfátlégzésről és karbonátlégzésről. A környezetbe kerülő szennyezések lebontásához az effajta légzésüket használjuk fel, mely során a szennyezőanyagok oxidálásával nyerik a szükséges energiát, miközben azok lebomlanak vagy kevésbé veszélyes, könnyebben bontható termékekké alakulnak.

4. Obligát anaerob mikroorganizmusok felszaporítása Egy környezeti elemben, esetünkben a talajban bekövetkező szennyezés elhárítása esetén rövid idő alatt és nagy mennyiségben kellene a lebontást végző mikroorganizmusoknak elszaporodnia. Ezen mikroorganizmusoknak talajban való jelenlét monitorozzuk a felszaporítás segítségével. Az eljárás a mikroorganizmusok talajmintából való könnyebb izolálását teszi lehetővé, mivel az izoláláshoz kellő számú mikroorganizmusra van szükségünk. Ha nincs kellő számú lebontást végző mikroba a talajban, akkor előre felszaporított formában juttathatunk a talajba, a lebontás meggyorsítása érdekében.

5. Obligát anaerob mikroorganizmusok felszaporítása A felszaporítás általában laboratóriumi körülmények között zajlik. A következőkben néhány obligát anaerob mikroorganizmus felszaporítását mutatom be részletesen. • Szulfát redukálók • CO2 redukálók • Cellulóz lebontó Clostridia felszaporítása

6. Szulfát redukálókfelszaporítása A szulfát redukálók obligát anaerob baktériumok, melyek az anaerob talajban és vízben fordulnak elő. Heterotrófok és hexózokat, alkoholokat, szerves savakat hasznosítanak szénforrásként. A szulfát mellett a szulfitot és a tioszulfátot is kénhidrogénné redukálja.

7. Szulfát redukálók felszaporítása Aszaporításhoz szükséges vegyszerek és oldatok: • 0,2 %-os NaCl oldat 0,2 g NaCl-ot 80 ml desztillált vízben feloldva, majd 100 ml-ig szintén desztillált vízzel jelre töltve és autoklávozva készül. • Só oldat hozzávalói 0,5 g K2HPO4 1,0 g NH4Cl 1,0 g CaSO4 2,0 g MgSO4.7H2O 5,0 g Na laktát (70% m/m) 10,0 g agar 930,0 ml desztillált víz Az oldat pH-ját 8,1-re állítjuk.

8. Szulfát redukálók felszaporítása • Vas-ammónium-szulfát [FeSO4(NH4)2.6H2O] oldat FeSO4(NH4)2SO4.6H2O oldat 3 egymást követő napon át tartó, napi 1 órás gőzölésével készül. • Élesztő kivonat-oldat 10%-os oldatot készítünk és autoklávozzuk. • Nátrium-tioglikolát oldat (10%) • Tápoldat, 1 l Autoklávozzuk az oldatot, lehűtjük, majd anaerob steril fülkében dolgozunk. 50 ml sterilszűrt vas-ammónia-szulfát oldatot, 10 ml élesztő kivonat-oldatot és 10 ml nátrium- tioglicerát oldatot adunk hozzá, majd a só oldathoz adagoljuk. Állítsuk be a végső pH-t 7,2-7,6 közé. Végül porciózzuk a táptalajt steril kémcsövekbe.

9. Szulfát redukálók felszaporítása Az eljárás A talaj mintával anaerob steril fülkében dolgozzunk, először szuszpendáltassuk NaCl oldatban. Készítsünk 1:10-es hígítást NaCl oldattal és oltsuk be a kémcsöveket 0,1-1,0 talaj szuszpenzióval. A legalább 4 hetes inkubációs periódus után válnak láthatóvá a szulfát redukáló baktérium telepek.

10. Szén-dioxid redukálók felszaporítása A szén-dioxid redukálók szintén obligát anaerob baktériumok. A következő reakciót katalizálják: H2+CO2CH4, acetát Csak vízzel elárasztott anaerob talajokban találhatók.

11. Szén-dioxid redukálók felszaporítása Aszaporításhoz szükséges vegyszerek és oldatok: • Vitamin oldat 1000,00 ml desztillált víz 2,00 mg biotin 2,00 mg folsav 10,00 mg piridoxin-hidroklorid 5,00 mg tiamin-hidroklorid 5,00 mg ribiflavin 5,00 mg nikotinsav 5,00 mg kalcium-pantotenát 0,01 mg B12 vitamin 5,00 mg p-aminobenzoesav 1,00 mg liposav 4 oC-on tárolva.

12. Szén-dioxid redukálók felszaporítása • Ásványi oldat 0,50 g Titripex I 6,20 g MgSO4.7H2O 0,55 g MnSO4.7H2O 1,00 g NaCl 0,10 g FeSO4.7H2O 0,17 g CoCl2.6H2O 0,13 g CaCl2.2H2O 0,18 g ZnSO4.7H2O 0,05 g CuSO4.7H2O 0,018 g AlK(SO4) 2.5H2O 0,010 g H3BO3 0,011 g Na2MoO4.2H2O

13. Szén-dioxid redukálók felszaporítása A Titriplex I-t oldjuk fel 10 ml NaOH (0,5 M)-ban és hígítsuk desztillált vízzel 500 ml-ig. Oldjuk fel a sókat is az oldatban és hígítsuk tovább 1000 ml-ig. • Redox közeg 165,5 ml desztillált víz 15,5 ml NaOH (1 M) 2,5 g cisztein.HCl.H2O 2,5 g Na2S.9H2O A NaOH-ot hígítsuk vízzel és óvatosan forraljuk fel O2 mentes nitrogén bevezetése mellett. Majd hűtsük jégen, adjuk hozzá a ciszteint és a Na2S-t, végül 4 hétig szobahőmérsékleten 250 ml-es edényekben autoklávozzuk. Ebből adjunk 1 ml-t a tápoldat 100 ml-éhez.

14. Szén-dioxid redukálók felszaporítása • Resazurin oldat 0,1 g resuzarint feloldunk 100 ml desztillált vízben és az oldatot átszűrjük sterilszűrőn. • Hígító folyadék 1,0 g NH4Cl 0,1 g MgSO4.7H2O 0,4 g K2HPO4 0,4 g KH2PO4 2,0 ml resazurin oldat 40,0 ml redox közeg Oldjuk fel 800 ml desztillált vízben és töltsük jelre 1000 ml-ig.

15. Szén-dioxid redukálók felszaporítása • Brómkrezol zöld agar 100 ml desztillált víz 1 g agar 0,01 g brómkrezol • Tápanyag oldat 950,00 ml desztillált víz 1,00 ml resazurin oldat 1,0 g NH4Cl 0,68 g KH2PO4 0,87 g K2HPO4 0,04 g MgSO4.7H2O 20,00 ml vitamin oldat 20,00 ml ásványi oldat 2,00 g élesztő kivonat 10,00 g NaHCO3

16. Szén-dioxid redukálók felszaporítása Állítsuk be a pH-t 7,8-ra, majd fokozatosan forraljuk fel a tápanyagot oldatot N2/CO2 (80%/20%) áram bevezetése közben. A hűtés után adjunk hozzá, 0,5g cisztein.HCl.H2O-t és 0,25 g Na2S.9H2O-t. Folyamatos gázkeverék áram mellett részletekben (100 ml) töltsük ki a tápanyag oldatot lapos üvegekbe, majd autoklávozzuk 120 oC-on 30 percig. A lehűlés után, ha szükséges újból állítsuk be a 7,8-as pH-t.

17. Szén-dioxid redukálók felszaporítása Az eljárás Anaerob, steril körülmények között (fülkében) szuszpendáltassunk 1 g talajt 10 ml hígító folyadékban. Egyenletes oszlassuk el 0,1 ml-es részleteit ezeknek a hígításoknak az agaron, folyamatos 67%-os H2 és 33%-os CO2 áram mellett. Zárjuk az üvegeket és inkubáljuk 37 oC-on néhány hétig. A metanogén és acetogén baktériumok megkülönböztetésére óvatosan öntsünk 5 ml-t a brómkrezol zöld agar oldatból a telepek tetejére. A sav-termelő telepek és a környékük sárgává fognak válni körülbelül 1 óra után, miközben a CH4 termelő telepek kékek maradnak.

18. Cellulóz bontó Clostridia felszaporítása A Clostridia obligát anaerob spórás baktérium, melynek elsődleges élőhelye a talaj. Szén és energiaforrásként cukrot, keményítőt, pektint, aminosavakat, szerves savakat, fehérjét és cellulózt egyaránt hasznosít. A cellulóz lebontó baktériumoknak kiemelt szerepe a növényi maradványok lebontásában, mivel azok egyik fő alkotóeleme a cellulóz.

19. Cellulóz bontó Clostridia felszaporítása Aszaporításhoz szükséges vegyszerek és oldatok: • Cellulóz szuszpenzió Tegyünk felaprított cellulóz és Nátrium-karboxi-cellulóz keveréket desztillált vízbe, hogy 2%-os (m/V) szuszpenziót alkossanak. • Hígító folyadék 1,0 g ammónium-szulfát 0,1 g MgSO4.7H2O 2,0 g NaCl 0,1 g CaCl2 1,3 g K2HPO4 0,7 g KH2PO4 Oldjuk fel 800 ml desztillált vízben az összetevőket, állítsuk be a pH-t 7,0-ra, majd töltsük fel 1000ml-ig desztillált vízzel és autoklávozzuk.

20. Cellulóz bontó Clostridia felszaporítása • A típusú só oldat 1 g ammónium-szulfát 2 g NaCl 13 g K2HPO4 Oldjuk fel 800 ml desztillált vízben az összetevőket, állítsuk be a pH-t 7,0-ra, majd töltsük fel 1000ml-ig desztillált vízzel és kevertessük autoklávval. • B típusú só oldat 50,00 ml desztillált víz 0,05 g MgSO4.7H2O 0,05 g CaCl2

21. Cellulóz bontó Clostridia felszaporítása • Resazurin oldat 0,1 g resuzarint oldjunk fel 100 ml desztillált vízben és szűrjük át sterilszűrőn. • Tápoldat 500 ml A típusú só oldat 200 ml cellulóz szuszpenzió 250 ml desztillált víz 1 ml resazurin oldat 15 g agar 1 g élesztő kivonat

22. Cellulóz bontó Clostridia felszaporítása Összekeverés után 1000 ml-ig töltsük fel desztillált vízzel, majd autoklávozzuk. Hűtés után (45 oC), anaerob tartályban tároljuk. Oldjunk fel 0,5 g Cisztein.HCl-t 50 ml B típusú só oldatban, majd sterilre szűrjük és adjuk hozzá a tápoldathoz. 45 oC-on, steril anaerob tartóban tároljuk szétporciózva. Az eljárás A talajmintával anaerob steril fülkében dolgozzunk. Először szuszpendáljuk 1 g-ját 10 ml hígító oldatban, majd oltsuk be az összes meleg agar csészét 0,1 ml szuszpenzióval (pár csészét csak hígító oldattal). Oszlassuk szét, hagyjuk megszilárdulni és inkubálni 28-35 oC-on. A cellulóz-bontó baktérium növekedését a cellulóz agar tisztulása fogja jelezni.

23. Forrás: Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995