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II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes

II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes. Généralités. Techniques de microscopie optiques (les moins traumatisantes) Marquage fluorescent des molécules à suivre. Concentrations ioniques. Microélectrodes (H + , Na + , K + , Cl - , Ca ++ ) mais pas rapide

sakina
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II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes

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Presentation Transcript

  1. II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes

  2. Généralités Techniques de microscopie optiques (les moins traumatisantes) Marquage fluorescent des molécules à suivre

  3. Concentrations ioniques Microélectrodes (H+, Na+, K+, Cl-, Ca++) mais pas rapide Indicateurs sensibles aux ions luminescents (aequorine de la méduse) fluorescents

  4. Autres ions Autres indicateurs fluorescents

  5. Anticorps Protéine cellulaire purifiée marquée Exemple tubuline Injection intra-cytoplasmique de molécules marqueur

  6. Fig 18-21 tubuline

  7. Fig 16-12 tubuline

  8. Injection intra-cytoplasmique de molécules pour bloquer une fonction • Anticorps anti myosine-II dans un œuf d'oursin bloque la division sans bloquer la mitose

  9. Quatre méthodes d'introduction de molécules dans la cellule • Microinjection • Électroporation • Vésiculation • Projection à haute vitesse…

  10. Fig 9-40 (AB)

  11. Fig 9-40 (CD)

  12. Molécules captives • Synthèse d'une forme inactive de la molécule • Introduction dans la cellule • Activation à un temps et moment donné par un faisceau lumineux • eg : molécules captives pour Ca++, AMPc, GTP, IP3

  13. La molécule X devient active après le flash d'UV Fig 9-41 Caged molecules

  14. Molécules fluorescentes piégées Grosse modification de la molécule qui doit rester active  grosse difficulté  Tâtonnement pour créer de nouvelles molécules eg : tubuline Application

  15. Tubuline rhodamine (rouge) Dapi ADN (bleu) Tubuline flourescéine piégée (mélangée aux autres et invisible avant le rayon d'UV) Fig 9-42 Caged tubuline fluorescéine Avant UV Après UV juste à gauche de la plaque métaphasique Après 1,5 mn Après 2,5 mn

  16. Desai,A1998

  17. Green Fluorescence Protein

  18. Fig 9-43 GFP

  19. GFP 3D

  20. GFP GFP Topol

  21. GFP mice

  22. GFP

  23. Isolement Séparation (FACS) Culture primaire et secondaire Milieu de culture Lignée cellulaire Transformation Congélation Clone Hybride III - Culture cellulaire

  24. Facs

  25. Hybride cellulaire

  26. Production AC monoclonaux

  27. Culture SEM

  28. ME Immuno-gold Immuno gold en ME

  29. Pulse-chase Patch-Clamp Molécules « piégées » Les anticorps immunofluorescence directe immunofluorescence indirecte Pistage de molécules dans la cellule

  30. Fig 9-46

  31. Autoradiographie en microscopie électronique Fig 9-47 5 mn de pulse de 3HLeucine dans cellules B de pancréas Après 10 mn de chasse Après 45 mn de chasse

  32. Fig 9-48

  33. Techniques biochimiques IV - Fractionnement des cellules et analyse des molécules

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