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Wilson K., Walker J.M. (a cura di) Metodologia biochimica Le bioconoscenze e le biotecnologie in laboratorio - nuova ed

Fabrizio Loreni Tel. 0672594317 E-mail loreni@uniroma2.it Antonella Ragnini Tel. 0872 570317 E-mail antonella.ragnini@uniroma2.it. Wilson K., Walker J.M. (a cura di) Metodologia biochimica Le bioconoscenze e le biotecnologie in laboratorio - nuova edizione

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Wilson K., Walker J.M. (a cura di) Metodologia biochimica Le bioconoscenze e le biotecnologie in laboratorio - nuova ed

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Presentation Transcript

  1. Fabrizio Loreni Tel. 0672594317 E-mail loreni@uniroma2.it Antonella Ragnini Tel. 0872 570317 E-mail antonella.ragnini@uniroma2.it Wilson K., Walker J.M. (a cura di) Metodologia biochimica Le bioconoscenze e le biotecnologie in laboratorio - nuova edizione Anno/Pagine: 2001 pp. 800 Euro: 99,00 REED Rob , HOLMES David , WEYERS Jonathan , JONES Allan METODOLOGIE DI BASE PER LE SCIENZE BIOMOLECOLARI volume unico p.344 Euro 37,50

  2. Descrizione generale esercitazioni di laboratorio Studio della localizzazione intracellulare della proteina SEC4 del lievito Saccaromyces cerevisiae Clonaggio di SEC4 in vettore per l'espressione in lievito di proteine di fusione con "tag" (GFP) Espressione di SEC4 in lievito e analisi della sua localizzazione mediante western blot di estratti frazionati Parte A 1) Isolamento di DNA genomico da lievito (I parte) 2) Isolamento di DNA genomico da lievito (II parte) Analisi spettrofotometrica del DNA preparato PCR su DNA genomico (preparazione frammento da clonare) 3) Preparazione di DNA plasmidico (vettore di clonaggio) con colonnina Digestione DNA (vettore e frammento) con enzimi di restrizione 4) Analisi su gel di agarosio Reazione con enzima "ligasi" 5) Preparazione piastre di agar Trasformazione batterica 6) Analisi risultati trasformazione Minipreparazione DNA plasmidico 7) Analisi su gel di agarosio 8) Fasi iniziali di Southern blot

  3. Parte B 9) Trasformazione con plasmidi ricombinanti di cellule di lievito inoculo per la preparazione di estratti proteici 10) Controllo trasformazione Preparazione degli estratti con glass beads e TCA. Frazionamento degli estratti 11-12) Bradford analysis e preparazione SDS-PAGE 13-14) Caricamento, corsa e Westernblotting (4h) 15-16) Immunodetection ECL. Discussione generale

  4. Acidi nucleici come materiale di studio • DNA endogeno • DNA esogeno (transgeni) • RNA strutturale • mRNA

  5. Isolamento acidi nucleici • lisi cellulare • deproteinizzazione • precipitazione

  6. Metodi di lisi cellulare

  7. Purificazione acidi nucleici • Deproteinizzazione: agenti enzimatici solventi organici • Precipitazione: cationi + etanolo (Na, NH4) isopropanolo

  8. Isolamento DNA plasmidico • Protocollo “artigianale” • Colonnine cromatografiche (kit commerciali)

  9. Protocollo artigianale Risospensione delle cellule in tampone con RNasi Lisi cellulare con NaOH/SDS Neutralizzazione con Kacetato (precipitazione di proteine) Estrazione fenolo/cloroformio Precipitazione con isopropanolo Risospensione in TE

  10. Isolamento DNA da cellule eucariotiche

  11. Isolamento DNA

  12. Isolamento RNA

  13. Purificazione mRNA

  14. Analisi acidi nucleici • Spettrofotometro • Elettroforesi su gel

  15. 1.5 Assorbanza (OD) 1.0 0.5 220 240 260 280 300 320 lunghezza d’onda (nm) Spettro di assorbimento del DNA 1 OD260=50g/ml OD260/OD280=1,8-2,0

  16. Amplificazione DNA • Clonaggio • PCR

  17. Clonaggio

  18. Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore (ligasi) Introduzione nella cellula ospite Selezione Minipreparazione di plasmidi per verifica

  19. Vettori plasmidici

  20. Reazione di ligasi • strategie • controlli

  21. GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG GpAATTC CTTAA G pAATTC G AATTC G G AATTC CTTAApG G CTTAAp G CTTAA DNA ligasi pAATTC G G CTTAAp EcoRI Trattamento del vettore con fosfatasi fosfatasi

  22. GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG AAGCTT TTCGAA AAGCTT TTCGAA GAATTC CTTAAG AAGCTT TTCGAA AGCTT A G CTTAA DNA ligasi AATTC G A TTCGA EcoRI Clonaggio con doppia digestione EcoRI HindIII HindIII

  23. Metodi di trasformazione dei batteri • Metodo del cloruro di calcio • Elettroporazione

  24. Strategie di selezione nel clonaggio

  25. Vettori plasmidici

  26. Strategie di selezione nel clonaggio

  27. Vettori di espressione

  28. Vettori di espressione inducibili

  29. Espressione proteine di fusione

  30. PCR (polymerase chain reaction)

  31. PCR • Scelta dello stampo • Scelta dei primer

  32. PCR da DNA genomico

  33. PCR da mRNA (RT-PCR)

  34. Uso dei “linkers”

  35. Vettori dA:dT 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’

  36. PCR da DNA genomico EcoRI BamHI EcoRI BamHI

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