Murilo Fernandes Pedroso, PIBIC (CNPq) Curso de Ciências Biológicas, Campus Tubarão

1. Estudo genético de populações de Aedes aegypti (diptera: culicidae) do sul do Brasil, pela técnica de RAPD-PCR Área Biológica Murilo Fernandes Pedroso, PIBIC (CNPq) Curso de Ciências Biológicas, Campus Tubarão Orientadora: Drª Onilda Santos da Silva Introdução A dengue tem sido considerada a arbovirose humana de maior importância epidemiológica, pois afeta 56 países no mundo (WHO, 2002). Segundo o Ministério da Saúde (2008), de janeiro a março foram registrados 120.413 casos de dengue clássica, 647 casos de febre hemorrágica da dengue e 48 óbitos. O principal transmissor dessa arbovirose ao homem é o Aedesaegypti. A dispersão desse mosquito ocorre através do vôo dos adultos, e no Brasil, o transporte passivo de ovos, larvas e adultos, por via rodoviária, também propicia a disseminação desta espécie para todas as regiões. Um estudo sobre o fluxo gênico dessas populações de Ae. aegypti poderia fornecer indicativos sobre uma possível variação genética da espécie. Desta forma, seria possível predizer se há isolamento genético ocasionado pela distância das populações do sul do Brasil em relação ao resto país, ou se são espécimes recentemente introduzidos de regiões endêmicas de dengue, o que possibilitaria grandes epidemias também nessa região do país. Poderia-se discutir também se essa diferença ou semelhança genética nas populações da região sul, em relação a outras do país, pode influenciar no modo como os mosquitos podem ter habilidade de transmitir a arbovirose. Assim, este estudo visa contribuir para um melhor entendimento sobre fluxo gênico em populações de Ae. aegypti da região sul do país, bem como servir de base para futuros estudos com esta ou outras técnicas de biologia molecular. Objetivos Geral: Estudar diferenciações genéticas em populações de Aedes aegypti de diferentes regiões do sul do Brasil, usando marcadores genéticos pela técnica de RAPD-PCR. Específicos: - Comparar geneticamente as populações da região sul do Brasil; - Comparar geneticamente as populações da região sul com outras de zonas endêmicas do país, como Rio de Janeiro e Recife; - Descrever os padrões de diferenciação ou similaridade das populações de Ae. aegypti das diferentes regiões do Brasil; - Entender os padrões de infestação desses mosquitos nas diferentes regiões do sul do Brasil. Metodologia Para a realização do estudo, utilizou-se larvas de Aedes aegypti obtidas através das Secretarias de Saúde dos estados de Santa Catarina, Rio Grande do Sul e Paraná. A metodologia para extração de DNA baseou-se no protocolo de extração de DNA de mosquito (Cheung et al., 1993 modificado por Roseli Wassen). Sendo assim, macerou-se uma larva de cada cidade em microtubo de 1,5 mL contendo 160μL de tampão de extração (Tris-HCl 200mM pH8,0, NaCl 2M, EDTA 70mM. Em seguida, adicionou-se 20μL de SDS 10% e submeteu-se o macerado a incubação por uma hora, a 60ºC. Após resfriamento a temperatura ambiente, foram adiconados 50μL de clorofórimio: álcool isoamílico (24:1) e o produto foi centrifugado por quinze minutos, a 13.000 rpm. Transferiu-se o sobrenadante para um novo microtubo, ao qual adicionou-se 80μL de acetato de amônio 7,5M e 300μL de etanol 96%, homogeinizando as amostras por inversão. A solução foi novamente encubada, por duas horas a -20ºC, e em seguida centrifugada a 13.000 rpm por vinte minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado com etanol 70%. Finalmente o DNA foi submetido a spin de quinze segundos em centrífuga e encubado em estufa a 37ºC para secagem. Em seguida, o DNA foi ressuspenso em 20μL de água MiliQ estéril e armazenado em freezer a -20ºC. Para a verificação da presença de DNA, as amostras (sem amplificação) foram submetidas à eletroforese à 60 V, em agarose gel 1,2%, corados em solução de brometo de etidio (1/ml) para visualização em transiluminador UV. Resultados Os resultados obtidos na pesquisa não contemplaram na sua totalidade os objetivos propostos, o que, entretanto, não invalida os dados obtidos e as soluções apontadas. Inicialmente, as larvas obtidas das Secretarias de Saúde foram identificadas com o auxílio da chave de identificação proposta por Oliveira & Consoli (1994), o que revelou a existência de espécies de Aedes albopictus presentes entre os Ae. aegypti. Durante o processo de extração do DNA, o protocolo sugerido no projeto não se apresentou eficiente, o que de imediato não revelou a presença de material genético ao final do processo de extração. Sendo assim, várias modificações foram realizadas na tentativa de estabelecer um protocolo de extração eficiente. Finalmente, após manutenção do transiluminador UV, troca de reagentes e novos testes, obteve-se um extração com o protocolo supracitado. No entanto, algumas das amostras não apresentaram arraste de banda e sim brilho na poli – o que pode ser explicado pela ausência de proteinase K no processo de extração. Conclusões Os objetivos propostos no projeto não foram alcançados. Entretanto, apesar dos resultados obtidos diferirem dos esperados, os mesmos apontam novos caminhos para a busca de soluções e assim reafirmam o caráter permanente de constante busca em pesquisa. Sendo assim, novos estudos se fazem necessários para a o estabelecimento de protocolos eficientes. Bibliografia APOSTOL BL, BLACK WC 4th, REITER P, Miller BR. Population genetics with RAPD-PCR markers: the breeding structure of Aedes aegypti in Puerto Rico. Heredity. 1996;76: 325-334. AYRES CF, MELO-SANTOS MA, SOLE-CAVA AM, FURTADO AF. Genetic differentiation of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae), the major dengue vector in Brazil. J Med Entomol. 2003; 40(4):430-435. BALLINGER-CRABTREE ME, BLACK WC 4th, MILLER BR. Use of genetic polymorphisms detected by the random-amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction (RAPD-PCR) for differentiation and identification of Aedes aegypti subspecies and populations. Am J Trop Med Hyg. 1992; 47(6):893-901. WHO - World Health Organization. Dengue prevention and control. Wkly Epidemiol Rec. 2002; 76: 217-218. Apoio Financeiro: CNPq / Unisul Fig.1 – Preparação de alíquotas de DNA Fig.2 – Cuba de eletroforese