Analiza structurala prin raze X

1. Analizastructuralaprin raze X Transformata Fourier sicristalografia de raze X Ceamai mare putere a rezolutieipentrudeterminareastructurilormacromoleculelorsicomplexelormacromoleculare

2. Matematic: transformata Fourier siinversaeiconvertescdintredouadomenii (“spatii”) r (exemplu: spatiusautimp) sidomeniul k (exemple: momentesaufrecvente)

3. Transformata Fourier

4. Pierdereafazeiprintransformata Fourier inversaunidirectionala Daca se considerafazacorecta Fazaincorecta (=0)

5. In douadimensiuni (xy) Aranjarehexagonala a “pick”-urilor Amplitudinesifaza

6. Unelecomponente au foststerse Se regasestedistributiainitiala Componente de amplitudinimici au continutredus de informatie

7. Aplicatie: metoda de reduce a zgomotului 1. Transformata Fourier a unuiobiectzgmotos 2. Se substituieanumitecomponente de amplitudine mica din transformata Fourier = 0 3. Se face transformata Fourier inversa

8. Doar o sectiuneprintransformata Fourier Distorsiunesemnificativadaca se folosestedoar un numarredus de coordonatepentrureconstructie

9. Exemplu de design experimental Imaginea de difractie a cristaluluiestetrasformata Fourier a structurii

10. Difractiape un singurpunct

11. Difractiapedouaobiectepunctiforme

12. InterferentaconstructivadacarS=0,+1, +2, • InterferentadestructivadacarS=+1/2, +3/2, • Imaginea de difractie F(S) este data de:

13. Pentru un obiect macroscopic constand din maimultepuncte cu diverse puteri de imprastiere:

14. Densitateaelectronica a structuriiproteineipoatefiobtinuta din inversatransformatei Fourier a imaginii de difractie

15. In microscopie, inversatransformatei Fourier estefacuta de catre lentile!

16. Nu existamicroscop de raze X cu rezolutiesisensibilitatesuficienta • Oglinzile de raze nu au rezolutieisuficientapentru o singuraproteina. • Puterearadiatieiartrebuisa fie prea mare iarproteinaarfi …. • denaturata

17. Procedeu general: • Se inregistreazaimaginea de difractie a cristaluluiproteic • Se calculeazainversatransformatei Fourier • Dezavantaj: se pierdeinformatia de faza

18. Problemafazelor • Metodeprin care se incearcacunoastereafazelor • Ceamaifolositametoda: inlocuirea cu atomigrei

19. Un specific al difractieipecristalemacroscopice: nu se obtine o image continua cispoturi de difractie

20. Reteacristalina in spatiul real/reciproc

21. Celulaunitara: ceamai mica unitate din care se poate genera cristaluldoarprintranslatii • Pentru un cristalproteiccelulaunitaraesteformata din unasaumaimulte molecule

23. Cristalografia de raze X a proteinelor http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/cgi-bin/pdbsum/GetPage.pl?template=highlights.html&pdbcode=n/a&highlights=TRUE

24. Producereaunorcristaleadecvate Monoscrital cu geometriesimarimepotrivita Transparente Faraneomogenitati Faraculoaresauindice de refractie Adecvate Neadecvate In mod obinuit, neadecvate

25. Metoda “picaturii”

26. Robot pentrumetodapicaturii

27. Se incepe cu o concentratie de proteina de 2-50 mg/ml • Nu trebuiesacontinacontaminanti (alteproteine, virusuri) • Faraproteineimpachetategresit • Faraaditivichimic care nu suntnecesari la stabilitate • Proteinele cu capetemaiputinflexibilecrsitalizeazamaibine • Dimensiunea optima a cristalului: ~0,1 mm

28. Existakituricomercialepetru “screening” de cristalizare http://www.jenabioscience.com/cms/en/1/browse/631_macromolecular_crystallography.html

29. Parametriimportanti: • Concentratiaproteinei • Tipurile de saresiconcentratialor • pH • Tipulsiconcentratiasurfactantilor • Temperatura • Viteza de cristalizare

31. Detector CCD (charge-coupled device)

32. Sursa: anodrotitorsausincrotron

33. Sincrotron

34. Imaginea de difractie

35. Determinareafazei, inlocuirea cu atomigrei Cristalizare in solutie care contineatomigrei

36. Calculareadensitatiielecronicesirafinareastructurilor http://www.netsci.org/Resources/Software/Struct/xray.html