Estudios de actividad de antifúngicos “in vitro”

1. Estudios de actividad de antifúngicos “in vitro” A.I. Suárez UGC Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica

2. Aumento nº infecciones fúngicas • Aumento nº pacientes disfunción sistema inmunitario: SIDA Transplantes Procesos oncológicos/quimioterapia agresiva • Aumento uso de antifúngicos de uso local y sistémico • Aparición de resistenciasantifúngicos • Necesario disponer de pruebas de sensibilidad a antifúngicos

3. Pruebas de sensibilidad a antifúngicos • Objetivo principal: detección mecanismos de resistencia en cepas productoras de la infección. • Objetivo secundario: seleccionar el antifúngico activo para esa infección. • Factores limitantes al estudio “in vitro”: • Características del antifúngico • Respuesta inmune paciente • Enfermedad de base del paciente • Tratamiento de base del paciente • Factores asociados al tipo de hongo, incluyendo sensibilidad a antifúngicos • Localización de la infección • Interacción paciente-hongo infectante-antifúngico

4. Métodos de detección de la resistencia a antifúngicos • Métodos de referencia: • Método CLSI (Clinical and LaboratoryStandardsInstitute) en Estados Unidos. • Método EUCAST (EuropeanCommitteeonAntimicrobial SusceptibilitySystem) en Europa. Microdilución, resultados similares, identifican cepas resistentes entre cepas sensibles, cepas controles . • Métodos comerciales: diseñados para el laboratorio clínico Difusión con discos o E-test, SensititreYeastOne, MicronautMicrodilution, Vitek. Facilidad uso, flexibilidad, estandarizados y rápidos (24 horas). Discrepancias (errores muy mayores) < 5%.

5. Detección molecular de resistencia antifúngicos Métodos no estandarizados M. Cuenca-Estrella. Clin Microbiol Infect 2014 (Accepted Article)

6. ¿Qué valor de CMI separa cepas sensibles y resistentes? • Puntos de corte, valores cut-off epidemiológicos : Candidaspp y Aspergillusspp. • Proceso multifactorial: • Análisis de la distribución CMIs • Relación entre valores de CMIs y eficacía clínica

7. Puntos de corte especie-específicos (EUCAST) Los puntos de corte epidemiológicos y clínicos poseen una mayor sensibilidad para detectar resistencias emergentes y tienen utilidad clínica.

8. Puntos de corte especie-específicos (EUCAST) Los puntos de corte epidemiológicos y clínicos poseen una mayor sensibilidad para detectar resistencias emergentes y tienen utilidad clínica.

9. Aplicación puntos de corte M.Cuenca-Estrella, J.L. Rodriguez-Tudela Expert Rev. Anti Infect. Ther. 2010; 8: 267–276.

10. Impacto nuevos puntos de corte CLSI 2012 Incremento % cepas resistentes Fothergill A.W. y cols. JCM (advance acces 8 Jan 2014)

11. Candidemias Suiza 2004-2009 ↑ R azoles: C.tropicalis y C.parapsilosis ↑ R Cas: C.glabrata y C.krusei Orash C. y cols.CMI 2013 ( accepted article)

12. Resistencia a antifúngicos • Resistencia microbiológica: el patógeno es inhibido por una concentración más alta de ese antifúngico, en comparación con la concentración que inhibe a las cepas sensibles (sin mecanismos de resistencia) • Resistencia clínica: el patógeno se inhibe a una concentración del antifúngico que conlleva una alta probabilidad de fallo terapeútico (concentración superior a la dosis normal y segura del antifúngico) • Resistencia microbiológica y clínica Consecuencias Resistencia M. A. Pfaller and D. J. Diekema J. Clin. Microbiol. 2012, 50:2846-2856.

13. Epidemiología • Gran importancia de la distribución de especies y sensibilidad a antifúngicos en diferentes países y a nivel local en cada hospital. Monitorización continua Estudio Candipop 05/2011-05/2012 5 ciudades, 29 hospitales Candidemias en España

14. Problemas: • C.glabrata: Hemisferio Norte: 30 %. Población anciana. • ↑R Fluconazol. 2º Candidemias • C.parapsilosis: Hemisferio Sur. Población más joven. • 2º Candidemias. ↑ candidemias (uso de Candinas). • C.krusei: 5º Candidemia. R intrinsecaFlu • ↑ Aspergillussppambientales/muestras clínicas con R azoles Candidemias Resistencia cruzada azoles Cambio epidemiólogico: Uso antifúngicos en Agricultura, Hospital y consumo antifúngicos orales en Atención Primaria: (Onixis, vaginitis;..) Flora comensal intestinal: reservorio infección sistémica

15. Estudios prevalencia sesgados incluyen aislamiento inicial, sin presión antifúngico: infraestima R adquirida. • Muestras de mucosas o infecciones profundas: % cepas R mayores. Dinamarca: 15% C.albicansFluR y 20% C.dubliniensisFluR muestras mucosas • R adquirida menos frecuente que R intrínseca, ya que los hongos no transmiten genes de R mediante plásmidos. La aparición de R tiene lugar en el paciente durante el tratamiento. • Relación fungicídas?: • Candidaspp aisladas en frutas no orgánicas: CMI elevadas Flu • Pesticidas (myclobutanil) induce expresión bombas expulsión en C.glabrata • CepasC.tropicalis↓sensFlu en pacientes no relacionados Japón, iguales a cepas aisladas de suelos con pesticidas. No se puede excluir que el uso de azoles en Agricultura tengan un papel en la R antifúngicos.

16. Mecanismos de resistencia en hongos levaduriformes • Azoles(Fluconazol, Voriconazol…): 10-25 % • Sobreexpresión genes codificantes de bombas de expulsión: bombas ABC(ATP bindingcassette), bombas MFS (majorfacilitatorsuperfamily) o ambas. • Mutaciones puntuales gen codifica la enzima diana ERG11: alteraciones estructura tridimensional proteína, conlleva menor afinidad unión demetilasa-antifungico: ↑ valor CMI. • Sobreexpresión o regulación elevada enzima alterado • Bypass que anulan el efecto azoles sobre la membrana • Pueden coexistir varios • Anfotericina B: 1-3 % • Equinocandinas (Caspofungina, Micafungina,…): rara • Mutaciones puntuales gen FKS1 que codifica la enzima 1-3 ß glucanosintetasa(síntesis glucanos pared) • Respuestas adaptativas al stress: ↑ contenido quitina pared y cambios aa que aumentan CMI. C.parapsilosis: CMIs altas. Cambio aa en Fks1 de la diana glucanosintetasa. Sin relevancia clínica.

17. DISMINUCIÓN CONCENTRACIÓN INTRACELULAR ANTIFÚNGICO Sobreexpresión bombas de expulsión: MDR: FZ CDR: azoles Modificaciónenzima diana Sobreexpresión diana Modificación otras enzimas M. A. Pfaller. Am J Med 2012; 125, S1-S14

18. M.C. Arendrup. Clin Microbiol Infect 2014 (Accepted article)

19. Candida glabrata Candida parapsilosis M.C. Arendrup. Clin Microbiol Infect 2014 (Accepted article)

20. 20-30 % Candidemias : especies con R intrinseca a Flu (Pre-azoles: 85 % C.albicans sensible a Flu Pfaller MA. J Clin Microbiol 2012: 50:1199-1203

21. Mecanismos de resistencia en hongos filamentosos • Azoles(Fluconazol, Voriconazol…): < 5% • Mutaciones gen Cyp51A: alteraciones estructurales enzima diana 14 -esterol-demetilasa: ↓ afinidad • Sobreexpresión bombas expulsión • Mutación región promotora Cyp51A : sobreexpresión proteína resultante. • Equinocandinas(Caspofungina, Micafungina,…): • Mutaciones puntuales gen FKS1 que codifica la enzima 1-3 ß glucanosintetasa (síntesis glucanos pared). • Polienos (Anfotericina B): rara. Excepción A.terreusy A.flavus: altas CMI.

22. DISMINUCIÓN CONCENTRACIÓN INTRACELULAR ANTIFÚNGICO Sobreexpresión bombas de expulsión: Aumento nº copias diana Modificación diana INTERACCION ANTIFÚNGICO-DIANA INEFICIENTE

23. M.C. Arendrup. Clin Microbiol Infect 2014 (Accepted article)

24. Resistencia adquirida Aspergillusspp • Sin Tratamiento previo: • 61% fungicídas agricultura: Europa Occidental, Asía, Pacífico. Prevalencia mutación TR34/L98h cepas aisladas en estos países. • 2 genotipos R en aislados R pesticidas • Prevalencia aislados ambientales:? Holanda 2007: 10% Dinamarca: suelos 8 % y pacientes: 4% (2009-2011) • Pacientes en Tratamiento azoles: • Aspergilosis crónica o alérgica con Tto larga duración (3 semanas) • Descrito en A.terreus y A.flavus • Pacientes en Tratamiento Candinas • 1 caso resistencia a Candinas . • Infradiagnósticada por problemas técnicos antibiograma (inhibición parcial crecimiento) • Pacientes en tratamiento > 3 semanas Prevalencia resistencia a azoles en 19 países (incluido España): 3.2 % (0-25%) Van Der Linden J. ICAAC 2011. Abstr M-490

25. Resistencia clínica • Diagnóstico incorrecto: • Tto empírico o anticipado • Sindrome de reconstitución inmune inflamatoria • Inmunosupresión paciente • Tratamiento tardío infección: gran nº organismos • Factores virulencia hongo: peor pronóstico • Interacciones antifúngico con medicamentos paciente • Foco infección • Tratamiento incorrecto en duración o cumplimiento • Enfermedad base paciente: • Prevención infección fúngica pacientes alto riesgo • Control enfermedad de base

26. Consecuencias resistencia a antifúngicos • Peor pronóstico y aumento mortalidad • Aparición infecciones de brecha durante la profilaxis antifúngica en pacientes con alto riesgo de infecciones fúngicas sistémicas

27. Indicaciones pruebas sensibilidad • Identificación a nivel de género y de forma óptima de especie. • Infecciones Candidasppaisladas de líquidos estériles: fluconazol y otros según epidemiología local. • Infecciones invasivas fallo tratamiento inicial, infecciones de brecha . • Tratamiento prolongado azolesy/o cultivos repetidos con el mismo hongo. • Si resistencia cruzada se ampliará estudio a antifúngicos de mayor espectro. • Infección invasiva hongos filamentosos raros u otros hongos. • Infección sistémica Aspergillusspp en tratamiento. • Hongos aislados durante profilaxis antifúngica. • Infecciones por Aspergillussppen tratamiento con azoles (Recomendaciones ESCMID) • Estudios epidemiólogicos No es necesario: Hongos con alto nivel de resistencia intrínseca C.krusei y Fluconazol A.terreus y Anfotericina B

28. Monitorización niveles antifúngicos Hongos filamentosos • ↑ coste y tiempo • Impacto clínico difícil estimar Itraconazol, Voriconazol, Posaconazol, 5 FC Niveles séricos impredecibles Alteraciones en la absorción, metabolismo, eliminación o interacción con otros medicamentos Niveles adecuados Eficacia TratamientoSin Toxicidad Previene emergencia resistencias Ashbee HR. J Antimicrob Chemother 2013 (Advance access Dec 29)

29. Desescalada en el tratamiento empírico • Objetivo fundamental en programas de optimización de la política de antibióticos. • Equipo multidisciplinar: microbiólogos, infectólogosy farmaceúticos: • Epidemiología local • Patrones de sensibilidad • Bibliografía actual • Desescalada basada en estudios de sensibilidad M.R. Ananda-Rajah. CurrOpinInfectDis 2012; 25:107-115 Se desescaló (estudio sensibilidad) en: • Candidemia especies FluS en TtoEquinocandinas: < 40% • Pacientes menos graves o C.albicans: 50% Shah DN. J AntimicrobChemother 2011;66:2146-2151 • Paso terapia parenteral a oral: Candidemias ESCMID: 10 días IV → oral • ↓ coste • Limita desarrollo R al reducir t exposición al antifúngico Bal MA. Int J ClinPract 2014; 68:20-27

30. Éxito clínico: Multifactorial R E. Lewis.Current Opinion in Infectious Diseases 2011, 24 (suppl 2):S14–S29

31. Conclusiones:Las pruebas de sensibilidad a antifúngicos: • Detección mecanismos de resistencia en hongo responsable de la infección. • Actualmente estandarizadas, en episodios de Candidemia se obtienen en 24 horas tras aislar el patógeno. • Comienzan a ser fundamentales en el tratamiento del paciente y en los estudios de vigilancia. • Resistencia microbiológica, clínica o ambas. • Diferentes mecanismos de resistencia: inducción bombas de expulsión, alteraciones o sobreexpresión en la enzima diana. • Indicaciones: infecciones sistémicas Candidaspp, hongos aislados durante profilaxis, fallos tratamiento inicial, infecciones invasivas por hongos filamentosos raros,….