PCR (Reação em cadeia da Polimerase) - SEQUENCIAMENTO

1. PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA (PPGB) Profa. Fabiana K. Seixas • PCR (Reação em cadeia da Polimerase) • -SEQUENCIAMENTO

2. PCR PolymeraseChainReaction Amplificação in vitro de uma seqüência específica de DNA * replicação in vitro

3. HISTÓRIA DA PCR • Kary Mullis (1983) • Prêmio Nobel Química (1993) • Revolucionou genética pesquisa genética medicina forense genética molecular

4. COMPONENTES DA REAÇÃO • DNA molde • Oligonucleotídeos (primer) • dNTP’s • DNA Polimerase • Magnésio • Tampão • Água

5. DNA POLIMERASE Thermusaquaticus -Estável a temperaturas de 177 graus; Temperatura Ótima: 72 graus

6. Thomas D. Brock no lago do “Yellowstone National Park” de onde foi isolado o Thermus aquaticus

7. EQUIPAMENTO TERMOCICLADOR

8. PCR Reação em Cadeia da Polimerase PCR se constitui hoje no método de rotina para isolar rapidamente sequências específicas a partir de uma mistura complexa de seqüências genômicas ou de cDNAs.

9. CICLOS DA PCR PCR Programa 94 0C por 5 min 94 0C por 1 min 55 0C por 1 min 72 0C por 1 min 72 0C por 5 min 4 0C 35 ciclos

10. O ciclo da PCR

11. ETAPAS

12. EXTRAÇÃO DO DNA

13. DELINEAMENTO DE PRIMERS Os iniciadores (oligos / primers) são a chave do sucesso ou da falha de um experimento com PCR. -Tamanho dos primers; - Estabelecimento das temperaturascorretas a seremutilizadas; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ National Center for BiotechnologyInformation

15. ANELAMENTO E POLIMERIZAÇÃO

16. ETAPAS DA PCR

17. ETAPAS DA PCR DESNATURAÇÃO ANELAMENTO POLIMERIZAÇÃO

20. ELETROFORESE

21. ELETROFORESE

22. VISUALIZAÇÃO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA

23. RESULTADOS Eletroforese do DNA em gel de agarose 0.8%

24. RESULTADOS

25. APLICAÇÕES DA TÉCNICA DE PCR • Diagnóstico de doenças infecciosas e genéticas • Amplificação de genes para posterior clonagem e expressão • Determinação de variabilidade genética • Deteção de OGMs • Sexagem de embriões • Estudo da expressão gênica

26. APLICAÇÕES DA TÉCNICA DE PCR Construção do DNA Recombinante Molécula de DNA de um plasmídeo linear com extremidades coesivas Molécula de DNA de um plasmídeo circular anelamento Clivagem com enzima de restrição Ligação covalente pela DNA ligase Inserção em uma célula hospedeira Molécula de DNA plasmidial contendo o inserto

27. APLICAÇÕES DA TÉCNICA DE PCR TESTE DE PATERNIDADE Gel de Poliacrilamida corado com Nitrato de Prata Trio Normal (sup. Pai, mãe e criança) ............................. R$ 600,00 Visualização do Gel em Paternidade Comprovada para um "loci" estudado

28. APLICAÇÕES DA TÉCNICA DE PCR Canadian Journal of Microbiology 2006 Nested - PCR

29. PCR – LipL32 Cepas do CCZ- Pelotas RS POSITIVO 37 Sorovares patogênicos NEGATIVO 7 Sorovares saprófitas Extração de DNA Especificidade dos Primers • Fervura; • CTAB; • SDS-Proteínase K NEGATIVO 15 microorganismos

30. PCR - LipL32 Limite de Detecção Cultura diluída em urina 200 Leptospiras 264 pb

31. Nested - PCR Limite de Detecção PCR - 264 pb Nested PCR -183 pb

32. Nested - PCR 16 amostras clinicas MAT + 10 Leptospiras

33. Leptospira X Brucela Leptospira Brucella

34. Leptospira X Brucela PCR

35. Leptospira X Brucela Multiplex PCR Nested- PCR

36. TAXONOMIA 17 espécies Genômicas <260 sorovares Intermediarias Patogênicas Leptospira fainei Leptospira broomii Leptospira inadai Leptospira interrogans Leptospira weilii Leptospira borgpetersenii Leptospira noguchii Leptospira santarosai Leptospira alexanderi Leptospira kirschneri Leptospira genospecies 1 Saprófitas Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachii Leptospira genospecies 3 Leptospira genospecies 4 Leptospira genospecies 5

37. Extração de DNA de L. interrogans Leptospira interrogans meio EMJH Extração de DNA PCR Gel de Agarose 94ºC – 5 min 94ºC – 1 min 50ºC – 1 min 72ºC – 1 min 72ºC – 7 min 30 ciclos

38. Caracterização Molecular VNTR

39. VNTR – Isolados M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 VNTR 10 VNTR 9 VNTR 19 VNTR 4 VNTR 7 VNTR 23

40. LIMITAÇÕES • Extração do DNA da amostra é crítica • Alguns compostos podem inibir a polimerase • Condições específicas para cada reação • Falsos resultados positivos devido a contaminação. • Falsos resultados negativos. • Análises conduzidas em laboratórios especializados.

41. http://www.pcrlinks.com/

42. SEQUENCIAMENTO DE DNA

43. MÉTODOS CLÁSSICOS • Clivagem química ou Método de Maxam-Gilbert (não é mais utilizado) • Método de Sanger: de terminação de cadeia com didesoxirribonucleosídeo trifosfato. • Manual • Automatizado SEQUENCIAMENTO DE DNA

44. TECNOLOGIAS DE SEQUENCIAMENTO • Sanger sequencing • PNAS 74 (1977), n. 12, 5463-5467 • SequenciadorMegaBACE (1Mpb/24 horas) • Pirosequenciamento • Science 281 (1998), n. 5375, 363-365 • Nature 437 (2005), 362-7 • Sequenciador 454 (150Mpb/24 horas)

45. SEQUENCIAMENTO DE DNA Grupo fosfato radioativo Método de Maxam-Gilbert Clivagem de uma molécula de DNA com reagentes químicos que atuam especificamente em um determinado nucleotídeo

46. SEQUENCIAMENTO DE DNA Método de Maxam-Gilbert

47. SEQUENCIAMENTO DE DNA Método de Sanger • Um dos mais utilizado é o chamado “método didesoxi” conhecido também como de “terminadores de cadeia” ou de “Sanger”

48. SEQUENCIAMENTO DE DNA Método de Sanger Polimerização

49. SEQUENCIAMENTO DE DNA Método de Sanger

50. 2´, 3´didesoxirribonucleotídeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reação de polimerização da cadeia de DNA