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ELABORADO POR: SULLY ESTEFAN Í A M Á RQUEZ AGUILAR

ESCUELA POLITECNICA DEL EJÉRCITO. DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA CARRERA DE INGENIER Í A EN BIOTECNOLOG Í A.

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ELABORADO POR: SULLY ESTEFAN Í A M Á RQUEZ AGUILAR

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  1. ESCUELA POLITECNICA DEL EJÉRCITO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA “IDENTIFICACIÓN DE REARREGLOS CROMOSÓMICOS ASOCIADOS CON TUMORES SÓLIDOS A PARTIR DE MUESTRAS DE TEJIDOS EMBEBIDOS EN PARAFINA (FFPE) Y DE TEJIDOS EN CONGELACIÓN (TOC), MEDIANTE LA APLICACIÓN DE LA TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN IN SITU CON FLUORESCENCIA (FISH)”. Previa a la obtención de Grado Académico o Título de: INGENIERA EN BIOTECNOLOGÍA ELABORADO POR: SULLY ESTEFANÍA MÁRQUEZ AGUILAR

  2. INTRODUCCIÓN • OBJETIVOS • MATERIALES Y METODOS • RESULTADOS Y DISCUSIÓN • CONCLUSIONES • RECOMENDACIONES • BIBLIOGRAFÍA • AGRADECIMIENTOS

  3. INTRODUCCIÓN Clasificación de los genes GENES SUPRESORES DE TUMORES Control fisiológico en la proliferación celular Caretakers MLH1 (Lynch syndrome) Gatekeepers PTEN PROTO ONCOGENES Landscapers Activación oncogénica • Mecanismos de inactivación: • Metilación del ADN y sellado genómico • Inestabilidad cromosómica (CIN). Fuente: http://www.scq.ubc.ca/how-to-catch-a-cancer/ Fuente. http://www.kmle.co.kr/search.php?Search=Oncogene.&Page=4

  4. INTRODUCCIÓN CÁNCER INICIACIÓN Cuatro tipos principales: Carcinomas (mama) Sarcomas (tejido conectivo ) Leucemias Linfomas Crecimiento anormal (alteraciones ADN ) PROMOCIÓN Alteración de procesos celulares fuertemente regulados: D, P, MCP PROGRESIÓN Fuente: http://cancerhelp.cancerresearchuk.org/about-cancer/what-is-cancer/cells/the-cancer-cell • PROPIEDADES • Indiferenciación • Habilidades proliferativas • Checkpoints • Reparación del ADN • Inmortalidad, angiogénesis, metabolismo alterado, inestabilidad genómica • Señalización anormal • Movimiento Dividirse rápidamente INVASIÓN Y METÁSTASIS TUMOR Fuente: http://www.tree.com/health/breast-cancer-stages.aspx Benigno Maligno

  5. INTRODUCCIÓN TUMORES SÓLIDOS

  6. INTRODUCCIÓN TUMORES SÓLIDOS

  7. INTRODUCCIÓN FISH Etapas • Híbrido (la citogenética y la biología molecular). • Detección de secuencias concretas de ácidos nucleicos (ADN o ARN)→ el empleo de sondas específicas marcadas con un fluorocromo. • Los 2 componentes principales : • Determinación de anormalidades recurrentes y rearreglos (diagnóstico y pronóstico). 1.Pretratamiento 2.Hibridación 4.Contratinción y visualización del ADN Sonda de ADN marcada con fluorescencia Secuencia diana 3.Lavados post-hibridación 2.Denaturación Fuente: http://filebox.vt.edu/users/chagedor/biol_4684/Methods/FISH.html

  8. INTRODUCCIÓN TIPOS DE SONDAS Sondas Pintado Cromosómico Sondas Teloméricas Sondas de Locus Específico Sondas Centroméricas Sondas Dual Color Dual Fusión Sondas de Fusión Sondas de Separación o Split

  9. INTRODUCCIÓN • OBJETIVOS • MATERIALES Y METODOS • RESULTADOS Y DISCUSIÓN • CONCLUSIONES • RECOMENDACIONES • BIBLIOGRAFÍA • AGRADECIMIENTOS

  10. OBJETIVOS General • Identificar rearreglos cromosómicos asociados con tumores sólidos en tejidos embebidos en parafina y en tejidos en congelación mediante la aplicación de la técnica de hibridación in situ con fluorescencia (FISH). • Analizar muestras de tumores sólidos, recolectadas desde marzo del 2011 hasta marzo del 2012, aplicando la técnica de hibridación in situ con fluorescencia (FISH) en tejidos en congelación y en tejidos embebidos en parafina. • Identificar los rearreglos cromosómicos asociados a tumores específicos en cada neoplasia en estudio mediante la valoración de sus núcleos. • Cuantificar la correlación entre los tumores en estudio con las variables sexo, edad, localización del tumor. • Comparar el diagnóstico por FISH con el histológico. Específicos

  11. INTRODUCCIÓN • OBJETIVOS • MATERIALES Y MÉTODOS • RESULTADOS Y DISCUSIÓN • CONCLUSIONES • RECOMENDACIONES • BIBLIOGRAFÍA • AGRADECIMIENTOS

  12. MATERIALES Y MÉTODOS TEJIDOS EMBEBIDOS EN PARAFINA

  13. MATERIALES Y MÉTODOS TEJIDOS EN CONGELACIÓN

  14. MATERIALES Y MÉTODOS VALORACIÓN DE NÚCLEOS

  15. MATERIALES Y MÉTODOS VALORACIÓN DE NÚCLEOS

  16. MATERIALES Y MÉTODOS VALORACIÓN DE NÚCLEOS

  17. INTRODUCCIÓN • OBJETIVOS • MATERIALESY MÉTODOS • RESULTADOS Y DISCUSIÓN • CONCLUSIONES • RECOMENDACIONES • BIBLIOGRAFÍA • AGRADECIMIENTOS

  18. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Detección de los rearreglos cromosómicos en los diferentes tipos de tumores sólidos Sarcoma de Ewing Figura 3.1. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de fémur con translocación 22q12 positiva en Sarcoma de Ewing (TOC) Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). Figura 3.2. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de origen retroperitoneal con translocación 22q12 positiva en Sarcoma de Ewing (FFPE) Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). • Diagnóstico definitivo, EWSR1/FL1(mejor pronóstico ) • RT-PCR y FISH 5 (Berkováet al. (2008))18 Qianet al. 16 Yamaguchi et al. (2005), nuevas sondas 90%.

  19. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Linfoma de Burkitt Figura 3.3. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de ganglio inguinal con translocación 8q14 negativa en Linfoma de Burkitt (FFPE)Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). Figura 3.4. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de ganglio con translocación 8q14 positiva en Linfoma de Burkitt (TOC)Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). • Gen C-MYC (iniciación de un proceso tumoral), t(8;14) pacientes adultos, revaloración (resultado desfavorable) Belaud-Rotureauet al. (2002), 4 t(11;14)(q13;q32)LCM 3 t(8;14)(q24;q32)LB, Moonet al. (2008) translocación doble del cromosoma 14

  20. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Cáncer de Mama Figura 3.5. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de mama con amplificación positiva para el gen HER2/neu en Cáncer de Mama (FFPE) Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). Figura 3.6. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de mama con amplificación negativa para el gen HER2/neu en Cáncer de Mama (FFPE). Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). • Tumor agresivo, con mayor resistencia a los tratamientos t< supervivencia • Prevenir efectos cardiotóxicos . • FISH vs Inmuno 50 Sui et al, 2009). 41 Su et al, (2011)

  21. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Neuroblastoma Figura 3.7. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de origen retroperitoneal con amplificación negativa del gen N-MYC en Neuroblastoma (FFPE) Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). Figura 3.8. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de origen retroperitoneal con amplificación negativa del gen N-MYC en Neuroblastoma (TOC) Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). • Gen N-MYC (altamente agresivo) Presencia de metástasis y un pronóstico pobre. • Sarteletet al. (2002)97 FISH vs SB/PCR amplificación heterogénea , Abdallaet al. (2009) 30, diagnosticado en todos los casos de tumores neuroblasticos periféricos ≠s

  22. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Otros tumores sólidos Figura 3.9. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra de ganglio retroperitoneal con translocación 2p23 ALK negativa en Linfoma No Hodking de células pequeñas (TOC) Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). Figura 3.10. Fotografía de núcleos en interfase de una muestra retroocular con translocación 2p23 ALK negativa en Retinoblastoma (TOC) Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011). • Gen ALK se asocia con el linfoma anaplásico de células grandes. ALK+(quimioterapia) y ALK− no muy favorable. • Li et al 22 FISH vs Imnumo 100% concordancia, Shinet al. (2003), 9 FISH (aspirados)

  23. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 3.1 Información y resultados del análisis de las diferentes muestras de tumores sólidos empleados en el estudio (N° de muestra, edad y sexo del paciente, diagnóstico médico, técnica histopatológica, técnica de FISH, tipo de tejido, tiempo de almacenamiento, localización topográfica y los resultados) obtenidos desde Marzo 2011 hasta Enero 2012.

  24. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

  25. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Características Operativas Histopatología vs FISH Curva de ROC Tabla 3.7 Características operativas de la técnica de FISH comparada con la de Histopatología (goldstandard) para los tumores sólidos mediante el software estadístico EPIDAT v3.1 (2012). Figura 3.16. Curva de ROC de FISH vs. Histopatología (goldstandard), obtenido mediante el software estadístico EPIDAT v3.1 (2012).

  26. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

  27. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Comparación de Resultados Histopatología vs FISH Tabla 3.8 Resultados obtenidos mediante la Histopatología y la técnica de FISH.

  28. RESULTADOS Y DISCUSIÓN VENTAJAS DE LA TÉCNICA FISH • Estudio de células en interfase y tiene alta sensibilidad. • No cultivo de tumores y Confirmación • Disponibilidad de sondas comerciales • Perspectiva médica • Diagnóstico pronóstico de una enfermedad genética • Investigación • Mapeo genético • Identificación de nuevos oncogenes • FISH multiplex • Decisión del tipo de tratamiento para combatir el cáncer Fotografía de una muestra de médula ósea en metafase con inv 16 negativa en leucemia mieloide aguda Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011).

  29. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DESVENTAJAS DE LA TÉCNICA FISH • Su uso depende de la disponibilidad de sondas. • Aporta información concreta dependiendo del tipo de sonda utilizada (screening). • Alto coste económico. • No en tejidos necróticos. • No se pueden detectar varias alteraciones simultáneamente Fotografía de una muestra de neuroblastoma en interfase con amplificación N-MYC negativa. Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011).

  30. INTRODUCCIÓN • OBJETIVOS • MATERIALESY MÉTODOS • RESULTADOS Y DISCUSIÓN • CONCLUSIONES • RECOMENDACIONES • BIBLIOGRAFÍA • AGRADECIMIENTOS

  31. CONCLUSIONES • Se realizó análisis de 20 tumores sólidos aplicando FISH sondas de locus específico (rearreglos cromosómicos específicos). • FISH permitió una adecuada identificación rearreglos cromosómicos esperados en TOC. Se evidenció en 3 SE, en 2 LB, en 4 NB, en 7 CM y 4 otros tumores sólidos (LNH). • La comparación entre las técnicas, sesgo → histopatología (screening) mientras que FISH (locus específico) influyendo →cálculo de las caract. Oper. FISH sensibilidad del 100%, de especificidad 33,33%, VPP del 50%, VPN del 100% y un IJ de 0,33. • Con la prueba Chi cuadrado de independencia (P=0,068), FISH independiente histopatológica pero al obtenerse una curva de ROC con un área 0,667 capacidad discriminatoria menor, (complemento) →un mejor diagnóstico de los rearreglos cromosómicos en tumores.

  32. CONCLUSIONES • Se obtuvo un valor de κ=0,286, (baja concordancia) FISH con respecto al estándar de oro, y prueba de McNemar P=0,0075, ≠s resultados. Sin embargo en aquellas muestras en las que se obtuvo un resultado (-) para el rearreglo cromosómico mediante la técnica en estudio, no significa que el diagnóstico histopatológico esté equivocado (otro tipo de alteración genética). • La técnica FISH es la más utilizada para el estudio de tumores sólidos sobre todo cuando existe un diagnóstico indeterminado. Además la identificación de los rearreglos cromosómicos específicos en las neoplasias en estudio (pronóstico, tratamiento y monitoreo)→ gran importancia a nivel clínico.

  33. INTRODUCCIÓN • OBJETIVOS • MATERIALESY MÉTODOS • RESULTADOS Y DISCUSIÓN • CONCLUSIONES • RECOMENDACIONES • BIBLIOGRAFÍA • AGRADECIMIENTOS

  34. RECOMENDACIONES • Para la comparación de técnicas se recomienda comparar a la técnica de FISH con sonda de locus específico con PCR o inmunohistoquímica (precisa). • Se recomienda para futuras investigaciones aplicar la técnica RT-PCR en las muestras de tumores sólidos en estudio para complementar el diagnóstico (resultado negativo). • Se recomienda utilizar la técnica FISH en aquellos casos en los que el cultivo de tumores presente dificultades (metafases, cariotipo y contaminación de las muestras). • Se recomienda utilizar FISH para la detección de rearreglos asociados a tumores que pueden ser muy difíciles de diagnosticar únicamente por su morfología. • Se recomienda utilizar FISH cuando el diagnóstico inmunohistoquímico indeterminado o equívoco (gen HER2/neu) en el cáncer de mama (paciente es positiva o negativa).

  35. RECOMENDACIONES • Utilizar FISH, para tomar la decisión (tratamiento) predecir la respuesta de los tumores a drogas usadas actualmente en la quimioterapia. • Citogénetica convencional →cariotipo post tratamiento MO, (monitorear al paciente durante y después de la terapia) • Protocolo (corte de tejido adecuado, respetar las temperaturas y una buena digestión con proteasa) • Para mejorar la aplicación de la técnica FISH (desarrollar nuevas sondas) que detecten genes candidatos →desarrollo y progresión del tumor (otros tipos de tumores sólidos).

  36. INTRODUCCIÓN • OBJETIVOS • MATERIALESY MÉTODOS • RESULTADOS Y DISCUSIÓN • CONCLUSIONES • RECOMENDACIONES • BIBLIOGRAFÍA • AGRADECIMIENTOS

  37. BIBLIOGRAFÍA • ACS. (2012). American CancerSociety. Extraído el 3 de Marzo de 2012, desde http://www.cancer.org. • Bown, N. (2001). NeuroblastomaTumour Genetics: Clinical and Biological aspects. JClinPathol, 54,897-910. • González N., Leonel A., Aristizábal B., y Beatriz H. (2010). Evaluación de tres métodos moleculares para el rastreo e identificación de HER2/neu. Medicina UPB, 29,17-40. • Haschek, W. (2009). Fundamentals of Toxicologic Pathology.Londres: Academic Press. • Hurria, A. (2010). Practical Geriatric Oncology. USA: Cambridge University Press • Iwamoto, Y. (2007). Diagnosis and Treatment of Ewing’s Sarcoma. Jpn J ClinOncol, 37, 79–89. • Khosravi, P., Pérez, G. (2006). Linfoma B difuso de células grandes. Med Clin , 127, 17-21. • Manzitti,J., Mansilla, M. (2010). Cuál es su diagnóstico? Descripción del caso presentado en número anterior: Retinoblastoma. Arch.Argent.Pediatr.,108 , 255-257. • NCI. (2010). Instituto Nacional del Cáncer. Extraído el 25 de Enero de 2012, desde http://www.cancer.gov. • Papaioannou, G., McHugh, K. (2005). Neuroblastoma in childhood:Review and Radiological findings. CancerImaging, 5, 116-127.

  38. INTRODUCCIÓN • OBJETIVOS • MATERIALESY MÉTODOS • RESULTADOS Y DISCUSIÓN • CONCLUSIONES • RECOMENDACIONES • BIBLIOGRAFÍA • AGRADECIMIENTOS

  39. AGRADECIMIENTOS

  40. “La confianza en uno mismo es el primer paso para el éxito" Anónimo

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