Účel sbírek kultur ex situ

2. Zachování genofondu živých organizmů, tedy biodiverzity, je jedním ze základních úkolů biologických oborů a současně výzvou pro obyvatele této planety. • Vědomí této potřeby vedlo ke vzniku Úmluvy o biologické rozmanitosti (Convention on Biological Diversity), přijaté 22. května 1992 v Nairobi, signované 5. června 1992 v Riu a vstoupivší v platnost 29. prosince 1993. Dosud ho podepsalo více než 140 států včetně ČR a Evropské společenství. • Zabránit zániku dalších druhů organizmů, včetně hub, lze jejich uchováváním ve sbírkách ex situ. • Sbírky kultur, nověsbírky genetických zdrojů (genetic resource collections), mají základní úlohu i v biosystematice. Ta vyžaduje přístup k co možná nejširšímu spektru materiálu příslušné skupiny zkoumaných organismů jak z hlediska geografického, tak ekologického (biotop, případný hostitel atd.). Sbírky živých organismů, které již umíme kultivovat ex situ představují základní materiál pro biosystematický výzkum, ať už používá morfologické, morfometrické, biochemické, kladistické, kultivační, cytologické, genetické, patologické, ultrastrukturální, molekulární, ontogenetické nebo jiné dnes dostupné přístupy. • Lze říci, že smysl sbírek genetických zdrojů pro zemědělství, biotechnologie, zdravotnictví, farmaceutický průmysl a další průmyslová odvětví a služby je už dnes všeobecně uznáván.

3. Ex situ je z odhadovaných existujících 1,5 milionu druhů hub uchováváno ve všech sbírkách dohromady necelé jedno procento. Vezmeme-li v úvahu pouze známé (popsané) druhy, pak cca 15 % druhů. • Ochranu si přednostně zaslouží zejména ohrožené a vzácné druhy hub, u nichž čas hraje klíčovou úlohu. • Sbírky kultur mají zásadní a rostoucí význam nejen pro zachování ohroženého genofondu (a tedy biodiverzity), ale i jako základní zdroj materiálu pro biotechnologické postupy, výzkum a výuku. Účinná práce totiž vyžaduje hodnověrné zdroje kultur, tj. definovaný a taxonomicky zařazený výchozí materiál. • Koordinaci práce sbírek zajišťují mezinárodní instituce: WFCC (World Federation for Culture Collections), MSDN(Microbial Strain Data Network), ECCF (European Council for Conservation of Fungi), ECCO (European Culture Collections´ Organization) ale i FČSM (Federace československých sbírek mikroorganismů)

5. Účel sbírek kultur ex situ • úložiště a ochrana kulturpro bezpečné uchovávání v geneticky stabilní formě • zdroj definovaných kulturpro biotechnologie, výzkum, výuku a studium biosystematiky • zachování biodiversityzejména ohrožených a vzácných druhů a referenčních kultur • poskytovatel služeb:distribuce, izolace a identifikace kultur, patentové kultury • vlastní výzkum:vývoj alternativních metod, screening kultur se specifickými vlastnostmi

6. Metody uchovávání hub • Prvním a nejdůležitějším problémem, který musí sbírky řešit, je způsob dlouhodobého uchovávání genetického materiálu. • Ideální metoda by měla umožnit konzervaci všech kultur organismů při uchování jejich specifických vlastností, ochránit kultury před kontaminací a vyžadovat co nejméně času, místa, práce a nákladů. Protože však taková univerzální metoda dosud neexistuje, je nanejvýš žádoucí vyvíjet nové a zdokonalovat již užívané metody uchovávání, které by spojovaly co nejvíce výhod a eliminovaly nevýhody jednotlivých postupů. • Uchovávání basidiomycetů je značně obtížné. Je to způsobeno několika faktory, k nimž patří např. skutečnost, že velká část basidiomycetů netvoří za obvyklých podmínek asexuální výtrusy, alespoň ne v dostatečném množství; převládající formou je mycelium s vysokým obsahem vody, a proto lyofilizace jejich kultur je velmi obtížná, i když se v současné době stala opět předmětem intenzivního zájmu. Velké komplikace přinášejí také mykorhizní vztahy. Obecně platí, že houby tvořící asexuální spóry jsou lépe uchovávatelné, naopak houby netvořící tyto spóry a houby mykorhizní se uchovávají obtížněji. Mykorhizní houby je často obtížné převést do čistých kultur a pokud se to zdaří, rostou často velmi pomalu.

7. Metody uchovávání hub • Ve sbírkách je používána řada metod uchovávání hub. Jejich společným jmenovatelem je – s výjimkou prosté subkultivace – potlačení metabolismu, vedoucí k prodloužení intervalu přeočkování a stabilizaci kultury. Je používáno uchovávání ve sterilní vodě, dlouhodobě úspěšné u řady nižších hub i některých basidiomycetů, ale jako univerzální metoda není použitelné, stejně jako uchovávání agarových kulturpod vrstvou minerálního oleje. Zkoušeno bylo i uchovávání na pevných dehydratujících nosičích(např. silikagelu) nebo přírodních substrátech (např. obilkyapod.). Nejrozšířenější je metoda uchovávání kultur v lyofilizovaném stavu (většinou však nevhodná pro nesporulující kultury) a vedle ní různé techniky využívající nízkých až ultranízkých teplot. • Pro kryoprezervacivláknitých hub byly původně používány zatavené skleněné ampule se suspenzí mycelia a/nebo spór, do které bylo nebo nebylo přidáno kryoprotektans. Později byly tyto ampule nahrazeny polypropylenovými kryozkumavkami a slámkami. Jako nosiče houbového mycelia byly původně užívány agarové bločky, ponořené v roztoku kryoprotektantu (Hwang, 1968). Posléze byla zavedena užitečná slámková (trubičková) technika s minibločky agaru, kterou vyvinul Elliott (1976) a vylepšil Stalpers et al. (1987). Modifikovanou slámkovou techniku, kde neuzavřené slámky byly umístěny v kryozkumavkách, popsal Hoffmann (1991). Chandler (1994) použil jako nosič pro kryoprezervaci konidií entomopatogenních hub komerčně dostupné porézní polystyrenové kuličky (systém Microbank od Pro-Lab Diagnostics), po něm je použili pro kryoprezervaci sporulujících kultur Aspergillus fumigatus při –800C Belkacemi et al. (1997), zatímco Palágyi et al. (1997) použil pro kryoprezervaci několika sporulujících kultur vláknitých hub a pro Saccharomyces cerevisiae při -700C porézní kuličky keramické. Je příznačné, že pro nesporulující vláknité houby nebyly tyto postupy použity. Již předtím však popsali metodu uchovávání baktérií na skleněných kuličkách při – 76 oC Feltham a sp. (1978). V naší laboratoři jsme zavedli využití perlitu jako inertního nosiče pro novou metodu kryoprezervace (Homolka et al., 2001).

8. Charakteristika metod uchovávání hub • Nejčastější, avšak pro dlouhodobé uchovávání nejméně vhodný způsob, spočívající v přeočkovávání kultur na agarových médiích, která jsou pak uložena v chladničce při cca 4 - 7 0C, skrývá nebezpečí postupné degeneracekultury (hromadění somatických mutací aj.) až její ztráty; to platí do jisté míry i pro výše zmíněné metody uchovávání ve vodě či pod olejem. Také infekce nebo napadení roztoči je častým problémem. • Jinak nejrozšířenější metoda uchovávání kultur –lyofilizace, použitá již ve čtyřicátých letech minulého století (Raper and Alexander, 1945) – je u basidiomycetů a ostatních hub nesporulujících in vitro značně limitována, protože ji za použití současných postupů většina těchto hub nepřežije. Většina pokusů o revitalizaci dehydratovaných houbových hyf až na několik výjimek selhala; vždy však musí být pečlivě ověřena skutečná nepřítomnost spór. Přes tyto málo povzbudivé výsledky byly v poslední době prováděny se střídavými úspěchy pokusy o mrazové sušení myceliálních hub, včetně basidiomycetů, modifikovanými postupy. Kromě vlastního procesu lyofilizace zde hraje významnou úlohu rychlost mražení a použité lyoprotektans. Lyofilizace kultur hub má řadu nezanedbatelných výhod proti všem ostatním způsobům uchovávání. Má nižší provozní náklady (není potřeba doplňovat kapalný dusík), je méně náročná na skladovací prostory i na přístrojové vybavení a zejména manipulace s lyofilizovanými kulturami je mnohem snazší (před distribucí není nutné je oživovat, mohou být okamžitě odeslány poštou, jsou lehké a malé a lze je skladovat při teplotách nad bodem mrazu bez nároku na speciální zařízení).

9. Charakteristika metod uchovávání hub • Jako vhodná alternativa pro nesporulující resp. neochotně sporulující basidiomycety a další takové houby se jeví metoda kryogenního uchovávání kultur při teplotě kapalného dusíku. Ani ta však zatím neřeší problém uchovávání všech houbových kultur. Nicméně se osvědčila jako nejspolehlivější a nejperspektivnější metoda pro dlouhodobé uchovávání velké většiny druhů hub, zejména těch, které nelze lyofilizovat. Jejími hlavními výhodami jsou uchování specifických genotypů, ochrana kultur před kontaminací a úspora času, místa a práce. Pro dlouhodobé uchovávání velkého počtu druhů hub byla zavedena v ATCC (American Type Culture Collection) již v roce 1960 a dává velmi dobré výsledky. Postupně ji začaly používat mnohé další renomované sbírky, jako je CAB International Mycological Institute, CBS Utrecht aj. Kryoprezervace zahrnuje proces zmrazení a rozmrazení (tání), jejichž technika hraje významnou úlohu. Názory na vhodnost pomalého nebo rychlého zmrazovacího postupu se vyvíjely poměrně rozporně a ani dnes nejsou jednotné. V současné době jsou rozvíjeny metody vitrifikace resp. enkapsulace a dehydratace, které by měly spojit výhody obou přístupů. Pro basidiomycety je udáváno jako obecně vhodné pomalé mrazení arychlé ohřívání, vitrifikační postupy jsou doposud v začátcích. V některých sbírkách, např. IFO Institute for Fermentation Osaka), používají úspěšně ke kryoprezervaci basidiomycetů (i nesporulujících) teplotu pouze –80 0C, dosahovanou v elektrickém mrazáku.

10. Charakteristika metod uchovávání hub • Na kryorezistenci má vliv mnoho faktorů: kmen, forma buňky, růstové podmínky (stáří, růstová rychlost, vzdušnění, kultivační teplota, složení kultivačního média, pH, obsah vody, lipidů, vakuol v buňkách, koncentrace biomasy, kryoprotektantu atd.). • Kryoprezervací dochází k poškození buněk, např.chladovým šokem (prudké snížení tepoty bez skutečného zmrznutí) a procesem mrznutí a tání (osmotický šok při pomalém a poškození krystaly ledu při rychlém procesu; východiskem může být vitrifikace při ultrarychlém mrznutí osmoticky „adaptovaných“ kultur). Rychlé rozmrazení je nutné pro zabránění krystalizace resp. růstu krystalů. • Kromě způsobu zamrazování je dalším důležitým faktorem použité kryoprotektans. Z celé řady testovaných látek došly největšího rozšíření glycerol adimetylsulfoxid(DMSO). • Neexistuje vztah mezi reakcí hub na zmrazování a tání a jejich taxonomickým zařazením. • Dalším faktorem, významným pro úspěšnost kryoprezervace, je schopnost zachování významných morfologických a fyziologických vlastností původního kmene. Naše výsledky ukázaly úspěšnost kryoprezervace některých hub bílé hniloby, kdy nebyl nalezen negativní vliv kryoprezervace ani použitého kryoprotektantu na tvorbu ligninolytických enzymů (Stoychev et al., 1998). • Podíl kultur přežívajících kryoprezervaci se pohybuje mezi 60 a 100%, což ukazuje na nutnost další optimalizace stávajících a vývoje nových kryoprezervačních metod.

11. Metody uchovávání hub - závěr • Všechny výše uvedené metody uchovávání mají své výhody a nevýhody, projevující se různě u různých skupin organismů, v našem případě hub. Navíc a hlavně, přestože tyto metody jsou v řadě případů značně propracované, pro nezanedbatelný počet kultur, zejména basidiomycetů, nelze některé z nich použít vůbec nebo jen s nejistým výsledkem. Tyto houby lze mnohdy sice převést do čisté kultury na pevném médiu, avšak po určitém počtu přeočkování u nich dochází k útlumu růstu a morfologickým a dalším změnám, tj. degeneraci, často končící jejich úplnou ztrátou.

12. Sbírka kultur basidiomycetů CCBAS • byla založena v roce 1959, nyní je přičleněna k Laboratoři biochemie dřevokazných hub Mikrobiologického ústavu AV ČR • obsahuje cca 730 kmenů téměř 260 druhů hub; zastoupeny jsou zejména řády Agaricales, Aphylophorales a Gasterales • je úložištěmněkterých chráněných druhů i patentovaných kmenů, základnou screeningu kmenů s významnými metabolickými aktivitami, dodavatelem kultur jiným institucím u nás i v zahraničí • uchovává kultury v kapalném dusíku za využití nejnovější technologie • po modernizaci v minulých letech se řadí k nejlépe vybaveným sbírkám • vyvinula původní provozní databázovou aplikaci a vlastní internetovou stránku www.biomed.cas.cz/CCBAS/fungi.htm • je členem WFCC, WDCM a FČSSM • provádí vlastní výzkum (vývoj alternativních metod uchovávání, screening kultur se specifickými vlastnostmi)

13. Sbírka kultur basidiomycetů CCBAS Podařilo se nám: • převésttéměř všechny naše kmenyna uchovávání v kapalném dusíku • modifikovaným postupem docílit po kryoprezervaci zachování významných morfologických a také fyziologických vlastností původních kmenů včetně produkčních • vyvinout novou metodu uchovávání v kapalném dusíku pomocí perlitujako nosiče

17. Perlit jako nosič kryoprezervovaného materiálu • Perlit je hlinitokřemičitý vulkanický materiál s jedinečnou schopností zadržovat a uvolňovat vodu, hojně využívaný ve stavebnictví, zemědělství a mnoha dalších odvětvích, mj. též jako purifikační agens. • Na dalších obrázcích je schématický popis současně používaného postupu kryoprezervace ve srovnání s námi nově vyvinutým postupem, na který budeme přecházet. • Jak vidíte, dochází ke zkrácení postupu o dva kroky a navíc má nový postup i řadu dalších výhod.

18. Současně používaný postup kryoprezervace kultur - modifikovaná metoda podle Hoffmanna Hoffmann, P.: Cryopreservation of fungi. Word J. Microbiol. Biotechnol. 7: 92 - 94, 1991

19. 7 kroků

22. Nový postup kryopreservace kultur na perlitu Homolka, L., Lisá, L., Eichlerová, I., Nerud, F.: Cryopreservation of basidiomycete strains using perlite. J. Microbiol. Methods 47: 307-313, 2001

23. 5 kroků

27. PODĚKOVÁNÍ za spolupráci Mgr. Ludmile Lisé Mgr. Ilkovi Stoytchevovi RNDr. Ivaně Eichlerové, PhD a Františku Nerudovi, CSc.