MUDr. Džubák Petr, Ph.D. Laboratoř experimentální medicíny při Dětské klinice

1. Membránový transport - mechanismy transportu malých molekul, makromolekul a experimentální transport do buňky. MUDr. Džubák Petr, Ph.D. Laboratoř experimentální medicíny při Dětské klinice Lékařská fakulta Univerzity Palackého

2. Doporučená a použitá literatura: Základy buněčné biologie – Alberts et al.Další zdroje:Biochemie – Voet &Voetová

3. Role membránových transportních proteinů

4. Transport molekul • volnou difusí, • dočasnými nebo trvalými póry, • usnadněnou difusí pomocí nízkomolekulárních nebo vysokomolekulárních přenašečů nebo • mechanismem endocytosy nebo exocytosy.

5. Propustnost lipidové dvojvrstvy Volná difuse

6. 1. Póry a kanály 2. Transportéry poháněné elektrochemickým potenciálem 3. Primární aktivní transportéry 4. Skupinové translokátory 5. Transmembránové přenašeče elektronů 6. skupina 7. skupina 8. Přídatné faktory v transportních pochodech 9. Neúplně charakterizované transportní systémy Klasifikace transportních proteinů Klasifikace transportních proteinů Arnošt Kotyk, Chem. Listy 97, 37 - 40 (2003)

7. 1.A α-Helikální kanály - 36 rodin • Transmembránové kanálové proteiny přítomné ve všech typech buněk. Katalýza pohybu solutů ve směru jejich potenciálového nebo koncentračního spádu. Jsou obvykle složeny z α-šroubovicových transmembránových segmentů. • 1.B β-Hřebenové poriny - 34 rodin • Energeticky nezávislý průchod solutů přes membránu. Transmembránové části proteinů obsahují pouze strukturu skládaného listu - β-soudky. Výskyt: vnější membrány gram-negativních bakterií, mitochondrií, chloroplastů a snad i gram-pozitivních bakterií rezistentních k nízkému pH. • 1.C Toxiny tvořící póry - 58 rodin • peptidy resp. proteiny tvořené v jedné buňce a secernované do membrány druhé buňky, kde způsobují perforaci. Ve výsledku dochází k zániku napadené buňky způsobenému výtokem elektrolytů a malých molekul, popř. naopak vstupem toxické látky do cytoplasmy. Perforins and perforins like. • 1.D Kanály syntetizované mimo ribosomy - 12 rodin • Nejčastější složení: řetězce L- a D-aminokyselin, laktát a β-hydroxybutyrát. Oligomerní transmembránové kanály. • 1.E Holiny - 19 rodin • Podtřída obsahuje integrální membránové proteiny, které regulují vstup fágových enzymů rozkládajících buněčnou stěnu (endolysinů). Holin a endolysin je potřeba pro usmrcení bakterie způsobené bakteriofágem. Značně variabilní skupina 1. Póry a kanály Klasifikace transportních proteinů Arnošt Kotyk, Chem. Listy 97, 37 - 40 (2003)

8. 2. Transportéry poháněné elektrochemickým potenciálem • 2.A Přenašeče neboli transportéry (uniportéry, symportéry, antiportéry) - 80 rodin • V této podtřídě jsou zahrnuty systémy na bázi uniportu, symportu a antiportu bez využití energie chemické vazby. • 2.B Přenašeče syntetizované mimo ribosomy - 6 rodin • Může jít o depsipeptidy nebo sloučeniny neobsahující aminokyseliny. Klasifikace transportních proteinů Arnošt Kotyk, Chem. Listy 97, 37 - 40 (2003)

9. 3.A Přenašeče poháněné hydrolýzou vazeb P-P - 14 rodin • Transportní systémy těžící z volné energie disfosfátové vazby - transport látek proti jejich koncentračnímu nebo elektrochemickému spádu. Některé proteiny jsou během transportního cyklu přechodně fosforylovány (rodiny 3.A.3 a 3.A.4). Tyto přenašeče se vyskytují ve všech doménách organismů. • 3.B Transportéry poháněné dekarboxylací - 1 rodina • Málo početné prokaryontní systémy využívající volnou energii dekarboxylace oxokyselin k transportu Na+. • 3.C Transportéry poháněné přenosem methylové skupiny – 1 rodina • Je známa jediná rodina takových přenašečů, a to z archebakterií. • 3.D Transportéry poháněné oxidoredukcí – 9 rodin • Systémy, kde zdrojem energie pro transport je oxidace redukovaného substrátu zprostředkovaná tokem elektronů. Vyskytují se ve všech domén•ch organismů. • 3.E Světlem poháněné transportéry - 1 rodina • Tato podtřída zahrnuje jedinou rodinu archebakteriálních proteinů. Homologní proteiny obsahující retinal se však vyskytují u plísní, kde mohou fungovat jako proteiny teplotního šoku, popřípadě jako molekulové chaperony. 3. Primární aktivní transportéry Klasifikace transportních proteinů Arnošt Kotyk, Chem. Listy 97, 37 - 40 (2003)

10. 4. Skupinové translokátory • 4.A. Fosfotransferasové systémy - 6 rodin • V této podtřídě jsou zahrnuty systémy, které katalyzují vektoriální enzymové reakce, kdy substrát je na startovní straně membrány a produkt, odlišný od substrátu, na cílové straně membrány. Klasifikace transportních proteinů Arnošt Kotyk, Chem. Listy 97, 37 - 40 (2003)

11. 5. Transmembránové přenašeče elektronů • nově objevená skupina několika proteinů, které přenášejí elektrony pro udržení cysteinových zbytků v redukované formě, popřípadě fungují v součinnosti s oxidasami tvořícími superoxidy. • 5.A Dvouelektronové transportéry - 2 rodiny • 5.B Jednoelektronové transportéry Klasifikace transportních proteinů Arnošt Kotyk, Chem. Listy 97, 37 - 40 (2003)

12. 8. Přídatné faktory v transportních pochodech • 8.A Pomocné transportní proteiny - 13 rodin • Podtřída zahrnuje proteiny usnadňující transport přes biomembrány bez přímé účasti na transportu. Příkladně se jedná o tvorbu membránového komplexu, o pomoc při využití energie, nebo regulaci transportu. Klasifikace transportních proteinů Arnošt Kotyk, Chem. Listy 97, 37 - 40 (2003)

13. Dvě třídy transportních proteinů

14. Koncentrace iontů uvnitř a vně buňky se mohou lišit.

15. Několik příkladů transportovaných látek.

16. Pasivní vs. aktivní transport

17. Trojrozměrná struktura přenašečového proteinu bakteriorhodopsin

18. Trojrozměrná struktura kanálového proteinu

19. Kinetické schéma membránového transportu

20. Ionofory

21. Pasivní transport

22. Gradient elektrochemického potenciálu.

23. Aktivní transport

24. Sodno-draselná pumpa 10-30x nižší

25. Model čerpacího cyklu sodno-draselné pumpy

26. Uniport-symport-antiport

27. Symport – pohon aktivního transportu druhé molekuly.

28. Na+-glukosový symport

29. Osmoza

30. Osmotické bobtnání

31. Rostlinná vs. živočišná buňka

32. Příklady přenašečových proteinů.

33. Struktrura iontového kanálu

34. Terčíkový zámek

35. Proud procházející iontovým kanálem

36. Řízené iontové kanály

37. Mechanicky aktivované kanály

38. Distribuce iontů – membránový potenciál

39. Úloha K+ při tvobě membránového potenciálu.

44. LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Transportní proteiny a jejich vztah k lékové rezistenci • P- glykoprotein (Pgp, P170) transport přes cytoplazmatickou membránu • Multidrug resistance related protein (MRP 1-7) ABC transportní • Breast cancer resistance protein proteiny (BCRP, MXR1, ABC-P) nukleocytoplazmatický transport • Lung resistance related protein (LRP, MVP)

45. LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE P-glykoprotein Schema struktury proteinu: • U lidí kódován genem mdr1 (dlouhé raménko chromozómu 7) • Nejdéle popsaný, nejznámější a dodnes klinicky nejvýznamnější protein asociovaný s MDR • ATP dependentní membránová pumpa exportující toxické látky z buňky a způsobující tak sníženou intracelulární akumulaci léčiva • Neprokázáno, zda se přímo uplatňuje v navození klinické rezistence, nebo zda je pouze indikátor více maligního fenotypu a tedy nepříznivým prognostickým znakem.

47. Rodina MRP proteinů LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Schema struktury proteinů: • jednosměrnáATP dependentní membránová pumpa pro glutathion-S-konjugáty • transportuje široké spektrum hydrofobních, záporně nabitých substrátů, nejvyšší je jeho substrátová specifita k leukotrienu LTC4 (úloha v regulaci zánětlivých procesů) • MRP pozitivní pacienti mají statisticky významně vyšší riziko relapsu, kratší dlouhodobé přežití, jsou rezistentnější na deriváty platiny, Doxo, MIT-C a VP-16

48. LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE BCRP protein Schema struktury proteinu: • nově popsaný protein z nadrodiny ABC transportérů • ABC polotransportér (aby byl funkční musí homo- či heterodimerizovat) • jeho specifickým inhibitorem je Fumitremorgin C izolovaný z mikroorganismu Aspergillus fumigatus • jeho exprese koreluje s klinickým průběhem onemocnění u AML pacientů s prognosticky nepříznivými cytogenetickými alteracemi, jeho zvýšená exprese by mohla být dobrým prognostickým markerem

49. LRP protein a organely vaults LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Struktura subcelulárních organel vaults: • tvoří 70% organel vaults, kromě LRP jsou vaults tvořeny ještě ze 3 druhů minor vault proteinů a malých molekul RNA • vaults jsou duté struktury, transportují toxické látky z jádra do lyzozómů, kde probíhá jejich degradace • k navození MDR fenotypu je potřebná celá funkční organela vault, nikoliv pouze zvýšená exprese LRP (léčivo je inaktivováno uzavřením v organele)