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Induzierbare Enzyme: Genotypische und phänotypische Charakterisierung

Prof. Dr. F. Meinhardt B-Kurs Mikrobielle Molekularbiologie Institut für Mikrobiologie WWU Münster. Induzierbare Enzyme: Genotypische und phänotypische Charakterisierung der bga R-Disruptionsmutante Bacillus megaterium MS970. - Ergebnisse WS 02/03 -.

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Induzierbare Enzyme: Genotypische und phänotypische Charakterisierung

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Presentation Transcript

  1. Prof. Dr. F. Meinhardt B-Kurs Mikrobielle Molekularbiologie Institut für Mikrobiologie WWU Münster Induzierbare Enzyme: Genotypische und phänotypische Charakterisierung der bgaR-Disruptionsmutante Bacillus megaterium MS970 - Ergebnisse WS 02/03 -

  2. 1. und 2. Woche: genotypische Charakterisierung - Isolation chromosomaler DNA aus B. megaterium DSM319/MS970 - Restriktion mit HincII - Gelelektrophorese - Transfer auf Nylonmembran (Southern Blot) - Nachweis zweier Restriktionsfragmente mit bgaR-Anteilen

  3. Genetische Organisation der bgaR-Disruptionsmutante MS970 im Vergleich zum Wildtyp DSM319 1.4 2.6 1.4 3.4

  4. Der Stamm MS970 ist Glucanase-positiv, der Stamm DSM319 negativ

  5. Gelelektrophoretische Überprüfung der isolierten chromosomalen DNA

  6. HincII-Restriktion der chromosomalen DNA

  7. Hybridisierung der chromosomalen DNA mit einem Digoxygenin-markierten EcoRI-Fragment aus pUCXL

  8. Ergebnis des Southern-Blots

  9. Quantifizierung der b-Galactosidase-Aktivität

  10. Ergebnis des b-Galactosidase-Enzymtests

  11. Der bgaM-Promotor ist von CREs (catabolite responsive elements) überlagert

  12. Das bgaR-Genprodukt ist ein positiver Regulator der b-Galactosidase-Expression bei B. megaterium

  13. Protokollgliederung • 1. Zusammenfassung • 2. Einleitung • - Prinzip Gendisruption • - bgaR / Disruptionsvektor pDXyl • - Versuchsziel • 3. Material und Methoden • - Abweichungen vom Skript • - Prinzip des Glucanase-Tests erläutern • - Prinzip des Southern-Blot / DIG-System erläutern • 4. Ergebnisse • - Ergebnis des Glucanase-Tests • - Ergebnis des Southern-Blot • - Ergebnis des Enzymtests • 5. Diskussion • - Genotypische Charakterisierung erläutern • - Welchen Rückschluß auf die Funktion von BgaR erlaubt der Enzymtest ? • - Vergleich der Mechanismen zur Katabolitrepression / Substratinduktion bei • E. coli / Bacillus, wo positive/negative Kontrolle ? • 6. Literatur • 7. Anhang • - Pipettierschemata • - Einzelwerte der photometrischen Messungen

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