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MICROBIOLOGIA – AULA 8 Listeria, Bacillus, Corynebacterium e Gardnerella vaginalis • QUESTÕES PARA AS PROVAS; • CONTEÚDO DAS AULAS; • ATIVIDADES ON-LINE; BLOG: http://chicoteixeira.wordpress.comchico.m.teixeira TWITTER: @ChicoMTeixeira MSN: ft.martins@hotmail.com e-mail: ft_martins@yahoo.com

Listeria http://www.youtube.com/watch?v=X1gTfXNOMhM&list=WLFGpiEnH7QcQYrFWqP-DFo-6D2QELjd5Y Quais os cuidados que você tem ao se alimentar? Você lava bem e desinfeta os legumes e verduras para as saladas? Você separa alimentos crus de alimentos cozidos e prontos para comer? Você lava bem as mãos?

Taxonomia e Características Consiste em bactérias gram-positivas, em forma de bastonetes regulares, anaeróbicas facultativas e não-formadoras de esporos constituídas de 6 espécies; Listeria monocytogenes pode ser dividida em 13 sorotipos, com base nos antígenos somático (S) e flagelar (H); Entre esses 13 sorotipos (1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e e 7), a maioria dos casos de doença é provocada pelos tipos 4b, 1/2a e 1/2b ;

Fatores de Virulência É um patógeno intracelular facultativo que tem a capacidade de invadir células de mamíferos e sobreviver no seu interior, incluindo macrófagos e várias linhagens de células humanas de cultura tecidual; http://www.youtube.com/watch?v=sF4BeU60yT8 Possuem uma proteína de superfície de 80 kDa denominada internalina. A internalina interage com um receptor de adesão celular, denominado E-caderina, presente nas células epiteliais humanas, resultando em indução de fagocitose;

Fatores de Virulência Uma vez dentro do intestino, Listeria expressa internalina que se liga à E-caderina no epitélio do hospedeiro1.A bactéria é engolfada pela célula epitelial do hospedeiro2.Ao escapar do fagossoma, Listeria se replica3 .Com cada nova bactéria tornando-se circunscrita por uma nuvem de actina4.A Listeria então se movimenta através da célula com a fomação de filamentos de actina5.Podendo contaminar outras células vizinhas e repetindo os passos de 3 a 5.

Fatores de Virulência Uma vez sequestradas nos fagossomas, Listeria produz a listeriolisina O e várias fosfolipases que possibilitam o escape do microrganismo do fagossoma antes que ocorra a fusão lisossomal, impedindo assim a sua morte intracelular;

Fatores de Virulência Uma vez no interior do citosol, outra proteína de superfície de Listeria, ActA, induz polimerização intracelular da actina; Tilney, L. G. & Portnoy, D. A., 1989.

Fatores de Virulência Esse processo resulta em translocação das bactérias para a superfície da membrana celular alvo, formando projeções semelhantes a pseudó-podos que se destacam e são ingeridas por mØs e outras células, como hepatócitos e enterócitos;

Fatores de Virulência Esses mecanismos permitem que a Listeria seja transferida diretamente de uma célula para outra sem nenhuma exposição a fatores imunológicos solúveis, como anticorpos e complemento;

Epidemiologia de L. monocytogenes Esse microrganismo pode ser isolado do solo, da água, de esgoto e vegetação, e faz parte da biota fecal de uma ampla variedade de animais; É contaminante comum de alimentos e crescem em biopelículas na superfície de queijos, leites, legumes e vegetais; A refrigeração aumenta o crescimento deste patógeno, em virtude de sua capacidade de crescer a 4ºC;

Epidemiologia de L. monocytogenes Devido à sua natureza ubíqua nos alimentos, os seres humanos devem entrar em contato diário com esses microrganismos e, alguns indivíduos, são portadores fecais de L. monocytogenes; O microrganismo é um componente transitório da microbiota fecal humana e pode ser excretado nas fezes em 1-10% dos seres humanos sadios;

Listeria monocytogenes Importância Clínica: Listeria monocytogenes está associada a um espectro de síndromes clínicas; A consequência mais comum da aquisição do microrganismo consiste num estado de portador gastrintestinal assintomático e transitório que resulta da ingestão de alimentos contaminados; Durante esse período, o microrganismo pode ser excretado nas fezes e, com frequência, ocorre infecção sintomática aguda pelos microrganismos durante a gravidez; A doença manifesta-se com sintomas semelhantes a influenza de febre, faringite, mialgia, mal-estar, dor na parte inferior do abdome e dor nas costas Por vezes, observa-se a ocorrência de secreção vaginal, diarreia e sintomas do trato urinário; http://www.youtube.com/watch?v=iXQOwCfZQek

Listeria monocytogenes Importância Clínica: Septicemia Meningite Listeriose Encefalite

Isolamento e identificação de Listeria monocytogenes L. Monocytogenes pode ser isolada de amostras de sangue, CSF e trato genital, de amostras de biópsia de tecido materno/fetal e do líquido amniótico; A semeadura direta em meio ágar e caldo, com incubação durante a noite, resulta habitualmente no crescimento do microrganismo; Em amostras clínicas e hemoculturas coradas pelo Gram, o microrganismo aparece como:

Isolamento e identificação de Listeria monocytogenes Bacilos gram-positivos regulares ou cocobacilos arredondados curtos e devido às variações que são observadas na morfologia dessa bactéria na coloração pelo Gram, podem ser confundidos com difteroides ou com certos estreptococos;

Isolamento e identificação de Listeria monocytogenes Os métodos para isolamento de L. monocytogenes dos alimentos diferem significativamente daqueles empregados para isolamento de amostras clínicas humanas e envolvem enriquecimento em caldo e repiques para vários tipos de meios seletivos, incluindo Chromagar;

Isolamento e identificação de Listeria monocytogenes L. Monocytogenes cresce bem em ágar sangue de carneiro, produzindo colônias brancas que se assemelham estreitamente às dos estreptococos b-hemolíticos do grupo B; Depois de 18 a 24 horas de incubação, colônias podem exibir uma zona estreita de b-hemólise que não se estende muito além da borda; Com incubação mais prolongada a b-hemólise dos microrganismos torna-se mais evidente;

Isolamento e identificação de Listeria monocytogenes Em virtude da semelhança das colônias de L. monocytogenes com as de enterococos e estreptococosb-hemolíticos do grupo B, não se deve estimular nenhum atalho na identificação laboratorial, assim as colorações de Gram e os testes para catalase devem ser sempre efetuados;

Isolamento e identificação de Listeria monocytogenes L. Monocytogenes é um bacilo gram-positivo facultativo e catalase-positivo, móvel e isto é observado em meios semi-sólidos;

Sensibilidade de L. monocytogenes a antimicrobianos Em geral, L. monocytogenes mostra-se sensível à penicilina, à ampicilina, aos aminoglicosídeos, à eritromicina, à tetraciclina, ao trimetoprim-sulfa-metoxazol e ao imipenem; As ciclosporinas (de primeira, segunda e terceira gerações) e as fluoroquinolonas não são ativas contra L. monocytogenes; A ampicilina é considerada a terapia de escolha;

Sensibilidade de L. monocytogenes a antimicrobianos Para pacientes com alergia à penicilina, acredita-se que trimetoprim-sulfametoxazol, com ou sem rifampicina, constitui o melhor agente alternativo para o tratamento das infecções causadas por L. monocytogenes; Os pacientes devem ser tratados durante pelo menos 3 semanas, dependendo do seu estado imunológico. Paciente HIV positivos podem fazer o tratamento permanentemente;

Espécies de Bacillus http://www.youtube.com/watch?v=TIpB2gV1iyk Quando você escuta o termo “guerra biológica”, o que vem à sua cabeça? Pela atual conjectura mundial é pertinente se preocupar com isso? Quais microrganismos seriam mais indicados para este propósito? Como podemos nos defender das toxinas?

Taxonomia e Características O gênero Bacillus compreende um grande grupo de bacilos gram-positivos aeróbicos facultativos, catalase-positivos, que possuem a capacidade de formar esporos em condições aeróbicas;

Taxonomia e Características Todas as espécies no gênero são aeróbicas ou facultativas, à exceção de B. infernos, que é uma espécie estritamente anaeróbica do solo; Com raras exceções, as espécies de Bacillus são mesofílicas e o principal patógeno desse grupo é Bacillus anthracis, o agente etiológico do antraz; Quase todas as espécies são móveis e possuem flagelos peritríquios (antígenos H), as exceções são Bacillus anthracis e Bacillus mycoides;

Taxonomia e Características Algumas espécies de Bacillus são utilizadas na fabricação e produção de antibióticos, vitaminas, em bioensaios e como microrganismo indicador na monitoração da eficácia de desinfetantes e procedimentos de esterilização (p. ex., autoclave, esterilização pelo calor e radiação;

Bacillus anthracis Importância Clínica: O antraz humano pode ser dividido em quatro formas clínicas, dependendo do modo de aquisição do microrganismo: 1) antraz cutâneo; 2) antraz por inalação ou pulmonar; 3) antraz orofaríngeo e 4) antraz gastrintestinal; É primariamente uma doença de animais herbívoros; os seres humanos são infectados em decorrência de seu contato com animais infectados e produtos desses animais; Nos Estados Unidos, essa doença foi erradicada como resultado do uso disseminado de vacinas humanas e de animais efetivas, desde o final da década de 1930, além dos avanços nos procedimentos de higiene e do maior uso de fibras sintéticas como alternativas do couro, pele e pêlos de animais; http://www.youtube.com/watch?v=7LRGT098lxc Porém, como os esporos são altamente resistentes a condições ambientais severas, deve-se manter um elevado índice de suspeita;

Bacillus anthracis Importância Clínica: Também foi explorado e desenvolvido como uma potencial arma biológica em vários países, tais como o Japão, a antiga União Soviética, o Reino Unido, Iraque e Estados Unidos; Em 1992, os soviéticos confessaram que em 1979 a liberação acidental de esporos do antraz de um laboratório militar resultou em mais de 77 casos de antraz por inalação, com mais de 66 mortes;

Bacillus anthracis Importância Clínica: O potencial de bioterrorismo foi alvo de maior ênfase nos últimos 4 meses de 2001, quando esporos foram enviados em cartas e pacotes por correio a localidades dos Estados Unidos; Esses incidentes resultaram em 11 casos de antraz por inalação e 11 casos de antraz cutâneo; E levaram à promulgação de legislação antiterrorismo nos Estados Unidos e ao desenvolvimento de uma agência de combate ao terrorismo;

Fatores de Virulência Bacillus anthracis produz toxinas constituídas por três proteínas distintas: o antígeno protetor (PA), o fator de edema (EF) e o fator letal (LF); http://www.youtube.com/watch?v=T1mlakCyscM As cepas virulentas de B. anthracis também são encapsuladas, graças ao gene plamidial pXO2; A exemplo da produção de toxina, a síntese do material capsular de B. anthracis é intensificada pelos níveis elevados de CO2 atmosférico e HCO3 tanto in vivo quanto in vitro;

Isolamento e identificação de espécies de Bacillus Os isolados de amostras clínicas do gênero Bacillus geralmente crescem bem e esporulam em ágar sangue de carneiro e ágar chocolate incubados a 37ºC em condições aeróbicas; A esporulação pode ser estimulada por repique em ágar nutriente suplementado com MnSO4 e incubação subsequente; Em amostras clínicas e hemoculturas coradas pelo Gram, o microrganismo aparece como:

Isolamento e identificação de espécies de Bacillus Bacilos gram-negativos, levando a uma impressão incorreta de que o microrganismo é um bacilo gram-negativo não fermentador; A semeadura em meio de caldo e a preparação de um esfregaço corado pelo método de Gram depois de algumas horas de crescimento podem revelar a natureza gram-positiva da bactéria;

Sensibilidade de B. anthracis a antimicrobianos Podem ser utilizados diversos agentes para o tratamento do antraz. A penicilina G em alta dose (4 milhões de unidades a cada 4-6 horas) constitui o fármaco de escolha; Nos pacientes alérgicos à penicilina, pode-se administrar ciprofloxacino (400 mg IV, a cada 8 a 12 horas) ou doxiciclina (200 mg IV, a cada 8 a 12 horas); A maioria dos casos de antraz por inalação é fatal

Sensibilidade de Bacillus a antimicrobianos É importante dizer que as cepas de B. anthracis são, em sua maioria, resistentes à cefalosporina enquanto outros patógenos do gênero Bacillus, tais como, B. cereus e B. thuringiensis produzem uma enzima b-lactamase que hidrolisa penicilina, ampicilina e cefalosporinas; No entanto, a maioria das cepas dessas espécies mostra-se sensível à clindamicina, à eritromicina, ao cloranfenicol e aos aminoglicosídios;

Espécies de Corynebacterium http://www.youtube.com/watch?v=5yGbxyOpZRk O que você entende por toxinas? Conhece alguém que sofreu ou algum caso de acidente com toxinas?

Taxonomia e Características O gênero é constituído de muitas espécies, mas o patógeno clássico é C. diphtheriae, o agente etiológico da difteria; Apesar de a difteria ser relativamente incomum nos países desenvolvidos, devido à ampla vacinação dos indivíduos suscetíveis, trata-se de uma causa de morbidade e mortalidade significativas nos países em desenvolvimento; O gênero Corynebacterium é constituído por bacilo gram-positivo pleomórfico, em forma de clava, que são catalase-positivos, imóveis, não-formadores de esporos e não-ácido-resistentes. As descrições clássicas desse gênero incluem a sua tendência a formar arranjos em “cerca” e “caracteres chineses”;

Taxonomia e Características As espécies são, em sua maioria, facultativas e fermentadoras no seu metabolismo, embora tb. ocorram algumas espécies não-fermentadoras ou que utilizam carboidratos de modo oxidativo; Muitas espécies também necessitam de lipídios (p. ex., SBA) e crescimento escasso ou ausente em ágar chocolate; O lipofilismo é mais bem demonstrado por um aumento no crescimento dessas espécies em meio contendo 0,1-1,0% de Tween 80;

Isolamento e identificação de espécies de Corynebacterium As necessidades de lipídios são determinadas pela semeadura da bactéria em meio sem lipídios (p. ex. ágar Mueller-Hinton, ágar BHI, ágar tripticase soja) e aplicação ao inóculo de uma gota de Tween 80 a 0,1%; Após incubação, as cepas lipofílicas exibem maior crescimento na área de deposição do Tween e crescimento escasso ou ausente nas áreas distantes do lipídio, já as cepas não-lipofílicas crescem sobre toda a superfície; Existem dois kits que efetuam a identificação de bacilos gram-positivos corineformes: o API Coryne e o RapID CB Plus;

Corynebacterium diphtheriae Importância Clínica: Constitui a causa da doença clássica conhecida como difteria;http://www.youtube.com/watch?v=Vjq9jRBEklg A infecção é evitada mediante imunização das populações em risco com toxoide diftérico; o uso desse material em diversos países levou a boas reduções na incidência de difteria; Apesar disso, a difteria continua sendo uma infecção ressurgente e letal, particularmente em certas partes do mundo;

Corynebacterium diphtheriae Importância Clínica: Na atualidade, o regime de imunização é de três doses intramusculares de DPT (toxoide diftérico, vacina acelular antipertussis e toxoide tetânico); A intervalos de 4 a 8 semanas para todas as crianças a partir de 6-8 semanas de idade, com administração de uma quarta dose dentro de 6-12 meses após a terceira dose; As crianças que completaram a primeira série de imunizações devem ainda receber dose reforço;

Corynebacterium diphtheriae Importância Clínica: C. Diphtheriae é o protótipo clássico de bactéria toxigênica, pois a virulência do microrganismo está relacionada quase totalmente à produção da toxina diftérica; http://www.youtube.com/watch?v=xKrqzG5zqEs A toxina diftérica é um polipeptídio formado por dois fragmentos: o fragmento A que constitui a parte responsável pela atividade e o fragmento B, responsável pela ligação à membrana celular das células alvo; http://www.youtube.com/watch?v=5yGbxyOpZRk

Corynebacterium diphtheriae Importância Clínica: A difteria do trato respiratório é primariamente transmitida entre seres humanos por contato direto ou por espirro ou tosse; Durante um período de incubação de 2-7 dias, o microrganismo multiplica-se localmente na parte posterior da nasofaringe e orofaringe, ocorrendo o acúmulo de microrganismos, fibrina e células inflamatórias, produzindo a pseudomembrana diftérica; http://www.youtube.com/watch?v=hcNtrESZhTE

Corynebacterium diphtheriae Importância Clínica: A pseudomembrana pode recobrir as amígdalas, a faringe, a laringe e a parte posterior das vias nasais; A extensão da pseudomembrana anteriormente pode levar ao comprometimento do palato mole e da úvula e nos casos graves, a pseudomembrana pode se estender na traquéia e nos brônquio, com consequente obstrução das vias aéreas; A extensão subsequente da pseudomembrana na parte posterior da nasofaringe e passagens nasais associa-se a uma secreção sanguinolenta ou purulenta do nariz que é altamente infecciosa;

Tratamento da difteria O tratamento da difteria envolve a administração de antitoxina equina para neutralizar a toxina ainda não ligada às células-alvo; http://www.youtube.com/watch?v=hcNtrESZhTE Não existe nenhuma terapia efetiva para reverter o comprometimento cardíaco ou neurológico passível de ter ocorrido antes de estabelecer um diagnóstico específico; O tratamento de suporte (traqueostomia, limpeza das vias aéreas, monitoração da função cardíaca) é necessário e de suma importância;

Tratamento da difteria A penicilina ou a eritromicina também podem ser administradas para acelerar a erradicação dos microrganismos do trato respiratório do paciente e tanto a rifampicina quanto a eritromicina foram utilizadas para erradicar o estado de portador de C. diphtheriae em indivíduos expostos; Para o isolamento são obtidas amostras de swab que são inoculados em placa de ágar sangue de carneiro e/ou em placa Columbia colistina-ácido nalidíxico (CNA), além de ágar Tinsdale modific.;

Gardnerella vaginalis Importância Clínica: Está associada a uma síndrome clínica denominada vaginose bacteriana, que é assim denominada pelo fato de não haver um microrganismo exclusivo responsável pela condição; Gardnerella vaginalis, inicialmente considerada associada à vaginose bacteriana, de fato atua sinergisticamente com bactérias anaeróbicas produzindo uma secreção malcheirosa; Foi relatado que a vaginose bacteriana não estava presente em 55% das mulheres nas quais foi isolada G. vaginalis; O isolamento de G. vaginalis na ausência de microbiota anaeróbica mista e sintomas constitui provavelmente a microbiota vaginal normal;

Gardnerella vaginalis Importância Clínica: Além de seu papel na vaginose bacteriana, G. vaginalis também foi isolada de infecções do trato genital feminino associada a complicações da gravidez, bem como de lactentes nascidos de mães com essas complicações; Essas complicações consistem em infecções intra-uterinas, infecções intra-amnióticas, corioamnionite, doença inflamatória pélvica pós-aborto e endometrite pós-parto após parto cesariana; http://www.youtube.com/watch?v=ZDaGbjSMk8M

Isolamento e identificação de espécies de Gardnerella O isolamento de G. vaginalis é mais bem obtido com meios semi-seletivos, embora a bactéria cresça efetivamente em SBA, ágar CNA e ágar chocolate; Os meios semi-seletivos incluem ágar com dupla camada de sangue humano-Tween (ágar HBT) ou ágar V; A identificação presuntiva de G. vaginalis baseia-se na morfologia celular típica em esfregaços;

Isolamento e identificação de espécies de Gardnerella No método de Gram são observados pequenos cocobacilos gram-positivos, gram-negativos ou gram-variáveis, no crescimento e na hemólise em ágar HBT (pequenos halos claros de colônias b-hemolíticas circundando colônias com bordas difusas e reatividade negativa de oxidase e catalase; A identificação definitiva pode ser efetuada com base nas reações bioquímicas;

Sensibilidade de Gardnerella a antimicrobianos Em geral, as cepas de G. vaginalis mostram-se sensíveis a penicilina, ampicilina, eritromicina, clindamicina, trimetoprim e vancomicina; O ciprofloxacina e o imipenem exibem atividade variável contra G. vaginalis e algumas cepas são resistentes à tetraciclina e à minociclina, além de acentuada resitência à amicacina, ao aztreonam e ao sulfametoxazol na maioria das cepas;

Muito Obrigado!!!

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