Maladies à prions : de la physiopathologie aux mesures règlementaires

1. 136 Dpt de Santé animale Maladies à prions : de la physiopathologie aux mesures règlementaires Frédéric Lantier Equipe «Génétique et physiopathologie des EST » Laboratoire « Infectiologie animale et santé publique Centre de Tours-Nouzilly

2. Les Encéphalopathies Spongiformes Subaiguës Transmissibles (ESST) • Peuvent affecter à la fois l’homme : maladie de Creutzfeldt-Jakob • MCJ sporadique (1920, 85% des cas) • MCJ familiale, IFF, GSS (1936, mutations PRNP, 13%) • MCJ iatrogène (chirurgie, greffe, hGH, 2%) • Kuru (1957, tribu des Fore, Nouvelle Guinée) • variant MCJ (Environ 200 cas dans le monde …) cf OIE • et l’animal : • Tremblante ovine et caprine (1738) • Encéphalopathie transmissible du vison (1964) • MDC (= CWD) des ruminants sauvages, USA (1980) • ESB bovine (1986) • ESF des félins, dérivée de l’ESB (1990)

3. VOCABULAIRE • Maladies à prions / Prion diseases = ESST (Encéphalopathies spongiformes –subaiguës- transmissibles) = EST = TSEChez l'animalMad cow disease = BSE / ESB = Maladie de la vache folle Scrapie = Tremblante du mouton CWD = MAC des ruminants sauvagesChez l'hommeMaladie de Creutzfeldt Jakob = MCJ = CJD vMCJ = CJDv (v pour variant ou nv nouveau variant) Syndrome de GSS IFF = FFI = Fatal familial insomnia

4. Caractéristiques des ESST • Maladies neurodégénératives actuellement incurables, générées par des agents transmissibles non conventionnels (ATNC) : les prions. • Longue période d’incubation : • humains : 5-40 ans • bovins : 4-6 ans • ovins : 1-5 ans • Souris : 100 à 800 jours • Absence de réponse immunitaire spécifique périphérique • Lésions localisées au niveau du SNC • spongiose, gliose (infammation) et mort neuronale • dépôt amyloïde d’une isoforme pathologique (PrPsc) d ’une protéine cellulaire de l’hôte (PrPc), la protéine prion.

5. Principales lésions du cerveau Mort de neurones Vacuoles Vacuoles PrPres PrPres Vacuoles PrPres

6. Les dépôts amyloïdes contiennent de laPrPres, forme agrégée d’une protéine normale, la PrPcLa PrPres forme des fibrilles (SAF) lorsqu’on la purifie SAF

7. La protéine prion (PrP) • PrP cellulaire (PrPc) : exprimée par de nombreux types cellulaires, fonction inconnue (homéostase du Cu, stress oxydatif, signalisation cellulaire, chaperone, développement embryonnaire…) • PrPsc, enrichie en feuillets béta, purifiée sous une forme agrégée et insoluble, les SAF : Scrapie-associated fibrils. • PrP pathologique (PrPsc) : isoforme anormale s’accumulant dans les tissus lymphoïdes et nerveux, plus résistante aux protéases et aux températures élevées (PrPsc = PrPres) PrPc===>PrPsc Hélices alpha : 43% ===>30% Feuillets béta : 3% ===>43%

8. PrP+/+ La présence de la protéine PrP est indispensable à la transmission des ESST PrP+/+ Souris normale : MALADE Cerveau de souris normale malade PrP0/0 Souris sans PrP : VIVANTE PrP+/+ Souris sans PrP+ gène PrP : MALADE

9. Le gène PRNP • est composé de 2-3 exons et de grands introns • est hautement conservé chez les Mammifères (primates, bovins, ovins, caprins, félins, visons, etc …) et a été identifié chez les poissons • a subi des duplications : PRND (doppel) et PRNT (testis) • présente un grand nombre de polymorphismes associés à une sensibilité aux ESST chez : • L’homme (prédisposition à MCJ, vMCJ, GSS, IFF) • La souris (durée de la période d’incubation) • Le mouton et la chèvre (prédisposition aux différentes formes de tremblante et à l'ESB)

10. La protéine PrPc. • Structure : • 254 AA (chez l’homme) • Octapeptides • 2 hélices alpha • 3 feuillets béta • 2 sites de N-glycosylations • Pont disulfure • Ancre GPI • Nter Non structuré (25-120) • C ter Globulaire (120-230)

11. PrPsc : agent causal des ESST ? • Hypothèse de la protéine infectieuse (Prusiner 1982) : • PrPsc = prion = “proteinaceous infectious organism”. Transconformation de la PrPc en PrPsc selon un processus autocatalytique, possible en milieu acellulaire (?) et transmissible. • Hypothèse virale : • apparition de PrPsc = épiphénomène, témoin de l’infection. • "Dernière" possibilité : activation d'un endogène viral • Hypothèse virino : • l’agent infectieux (AN ?) protégé par la PrPsc particulièrement résistante de l’hôte PrPsc : actuellement le seul marqueur biochimique spécifique de l’infection.

13. PMCA : Détection d'infimes quantités de PrPsc • Dans les tissus/fluides/matériaux infectés • Sang, lait … • Environnement • Chez les animaux sains et même réfractaires • Présence/fabrication "permanente" de protéine mal conformée (Castilla et al, 2007) • Contrôles négatifs, seuils ??? • Mécanismes de surveillance/contrôle ? • PMCA voit son efficacité augmentée par molécules chaperones : homogénats tissus, Ac. Nucléiques • In vitro …ARNs synth., cell., ou viraux. • In vivo … microRNA, ARN viraux ???

14. Co-localized massive appearance of endogenous murine retroviruses and increased PrP expression in immune*-stimulated splenic FDC networks * By Immun complexes Dotlike gold particles represent immunostaining specific for MLV Env protein. (B) Co-localized immunofluorescence staining of PrP and MLV Env in splenic germinal center. Semithin (400 nm) cryosection was double-stained with rabbit serum specific for PrP and rat monoclonal antibody specific for MLV Env. Bar, 25 mm. Loetscher M, Recher M, Lang KS, Navarini A, Hunziker L, et al (2007) Induced Prion Protein Controls Immune-Activated Retroviruses in the Mouse Spleen. PLoS ONE 2(11): e1158.

15. En pratique, la PrPsc reste le seul marqueur biochimique des ESST : principales techniques de diagnostic des EST Histologie Micro. Électronique(SAF) Immunohistochimie Histoblots Inoculation à la souris Western-blot IEC-LIF ELISA

16. Profils électrophorétiques de la PrPc et de la PrPsc PrPscPrPc PrPc PrPsc 2 sites de glycosylation,3 formes : 33-35 kDa bi-glycosylée 27-30 kDa mono-glycosée non glycosylée Protéinase K – + +

17. Une infection "naturelle" par l’ESB détectée chez une chèvre française

18. Typage de souche - zones d’observation des lésions 8 9 6 7 5 3 4 Substance grise Substance blanche 3 2 1 2 1 Fraser and Dickinson, 1968, J Comp Pathol, 78:301

19. ESB - Lésions sur souris RIII :Vacuolisation du noyau cochléaire dorsal Green et al, J Comp Pathol, 2005

20. Bovins Tremblante Chats, ruminants sauvages vMCJ spMCJ Profil lésionnel sur souris RIII : caractère unique de la "souche" ESB ESB NON ESB Mouton, chèvre, porc 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Bruce et al, 1997

21. Nor98 : une souche de tremblante atypique • Première description en Norvège en 1998 (Benestad et al, Vet Record, 2002) : • identifiée depuis dans plusieurs pays européens (F, D, B, GB…) • distribution inhabituelle des lésions cérébrales et des dépôts de PrPsc • aucune atteinte du système lymphoïde, même chez les ARQ/ARQ • préférence allélique naturelle pour A136F141RQ et génotypes habituellement résistants, • transmissibles à la souris transgénique (allèle VRQ ovin) (pas à la souris conventionnelle) Ces isolats sont difficiles à dépister par certains tests rapides Des animaux de génotypes résistants ARR/ARR sont infectés naturellement

22. Nor98 Classiques Har And Årn Min Lin Str Lav Før Hat Cort Més Cervt Cort Cort Cort TC TC TC 25 15 10 AHQ AHQ AHQ AHQ AHQARQ ARQ ARQ VRQ ARQ ARQ AHQ AHQ AHQARQ ARQ VRQ VRQ Caractérisation de la souche NOR98 (Benestad et al., Vet Rec, 2003,153:202)• Description d’un type de tremblante atypique et original en Norvège(régions concernées, âge des animaux, clinique, génotypes touchés, répartition des lésions, profil électrophorétique de la PrPsc) Cervelet Obex N. lymphatique Nor98 (ARQ:ARQ) Classique

23. Les isolats français atypiques ont le même profil lésionnel que les isolats Nor98 Profils lésionnels Histoblots

24. Modification de la virulence des souches par passage successifs • Phénomène largement décrit pour les agents des ESST (et de nombreux virus) • Diminution de la durée d’incubation (x 1/3) • Adaptation au nouvel hôte (passage à 100%) • Multiplicité des « souches » chez un même animal • Difficilement explicable par l’hypothèse d’une protéine infectieuse …. Si les souches ont une réalité biologique • Mais la souche ESB semble unique : conservation de ses propriétés après passage « alimentaire » (chat, guépard, chèvre , homme) ou expérimental (souris dont transgéniques, ovins, porc ) ; bémol : nombre de passage • Souches atypiques (NOR98) : • modifications spontanées de la PrPc en PrP pathologique, devenant transmissible : origine des ESST ?

25. 1 - ESB et mie de Creutzfeldt-Jakob (MCJ)

26. ESB Mouton ? MOUTON ? CHÈVRE Homme(vMCJ) Ruminants sauvages (zoo) Singes (zoo) Chat domestique Panthère, puma… (zoo) ESB : tout commence par un sac de farines de viande et d’os… 1986 1974 ??? Vache ? FVO … Homme ?

27. L’ESB au Royaume-Uni depuis 1985 Plus de 184 471 cas en Mai 2007 Incubation Interdiction des farines 67 cas en 2007 >10 en 2008 Confirmation de la maladie

28. ESB dans le monde (Mai 2007) Japon 32 Slovaquie 20 Danemark 18 Slovénie 5 Canada 4 Luxembourg 3 Liechtenstein 2 Oman 2 USA , Autriche 2 Koweit 1 Falklands Isl. 1 Finlande 1 Grèce, Israël 1 • Royaume-uni 184 471 • Rep. d’Irlande 1601 • France 996 (+ 4) • Portugal 1038 • Espagne 686 • Suisse 463 • Allemagne 412 • Belgique 133 • Italie 143 • Pays-Bas 83 • Pologne 33 • Rép. Tchèque 26

29. L’ESB en France 996 cas – mars 2007

31. Maladie de Creutzfeldt-Jakob (MCJ)A • Fréquence : 1,5 cas/an/million d’habitants (1 centaine de cas/an en France) • Formes « classiques » % Origine Nbre de cas en F (1992->) • sporadique (spMCJ) 85 ? 1040 • familial (fMCJ) 13 Génétique (familiale) 108 • iatrogène (iMCJ) 2 Greffes, neurochirurgie 11 • Hormone de croissance (110 cas en août 2008) • Variant MCJ (vMCJ) • près de 200 cas dans le monde (R-U: 164 - Fra: 22 - Irl: 2 - Ital, USA, Can, NL, P, E, J: 1) • Moyenne d’âge ~ 30 ans (incubation courte) (spMCJ ~ 60 ans) • Symptômes et lésions inhabituels • Origine = ESB

32. Nombre de cas certains ou probables de MCJ en Francepar année de signalement pour les suspicions, par année de décès pour les cas de MCJ décédés Mise à jour du 1er septembre 2008 (INVS)

33. par cannibalisme • (pas de barrière d’espèce) : • Kuru chez les Fore, Nlle Guinée (Gajdusek,1957) • ESB (vache, ruminants de zoo) • par régime carnivore • (franchissement de la barrière d’espèce) : • ESB des félidés • ES du vison • vCJD de l’homme ? • par transmission horizontale (et verticale ?) • Tremblante des petits ruminants • CWD des ruminants sauvages aux USA Les EST sont transmissibles naturellement…

34. 2 – Physiopathologie : Exemple des ESST ovines Amaigrissement Troubles du comportement Pertes de laine (grattage) Troubles de la démarche

35. Le gène de la protéine PrP détermine la sensibilité aux ESST Exemple : génétique de la résistance d’un troupeau ovin INRA à une souche de tremblante « classique » Codon Genotype Fréquence 136154171 animx malades VRQ +++ ValArgGln ARQ ++ AlaArgGln AHQ + AlaHis Gln ARR – AlaArg Arg

36. Les TSE sont aisément transmissible par voie orale chez les ovins génétiquement sensibles • Infection précoce (détectable dès 1 mois) • via les plaques de Peyer de l’iléon • Macrophages / IDC • Cellules dendritiques folliculaires • Puis dissémination "rapide" • au ganglion drainant, ou directement au sang • au tissu lymphoïde associé au tube digestif (GALT) • à l’ensemble des organes lymphoïdes secondaires • via le système nerveux entérique et/ou le sang • Atteinte du SNC à ± mi-incubation vers 10 mois

37. Entrée par les plaques de Peyer : Tissu lymphoïde associé au tube digestif (GALT) iléon jéjunum proximal (from McL. Press et al, 2004)

38. Plaques de Peyer

40. Accumulation de PrPsc dans les follicules B Macrophages, IDC Réseau de FDC, centre germinatif (x 200)

41. Accumulation de PrPsc dans les follicules B Réseau de FDC, centre germinatif Macrophages, IDC (x 600)

42. Rôle des macrophages/DC dans les phases précoces de la pathogénèse des ESST - Comme dans les pathologies conventionnelles, ces cellules peuvent contrôler l’infectiosité de l’agent des ESST et limiter la réplication précoce de l’ATNC. - En tremblante naturelle, ou après infection expérimentale par voie orale, ces cellules constituent des candidats pour différents mécanismes de transmission de l’agent infectieux : - capture de la lumière intestinale vers les follicules B des plaques de Peyer, - dissémination au sein du GALT et vers l’ensemble des organes lymphoïdes secondaires, - transfert, dans les tissus lymphoïdes, des FDC vers les terminaisons nerveuses sympathiques et parasympathiques conduisant à l’infection du SNE, étape-clé de la neuroinvasion.

43. Voies de contamination possibles à partir des plaques de Peyer 1- Capture par macrophage/DC, réservoir FDC 2- Capture par macrophage/DC, atteinte SNE/voie sanguine 3- Voie directe SNE

44. Différents types d’accumulation de la PrPsc dans les organes lymphoïdes Rate agneau –marquage périfolliculaire Rate mère infectée : marquage classique (x 200) (x 200) Amygdale agneau (x 200)

45. Digestive tractus and enteric nervous system Vagal nerve (parasympathetic) Sympathetic nerve Sub mucosal Plexus Myenteric plexus

46. Accumulation de PrPsc dans le SNE

47. Cell types involved in PrPsc dissemination in spinal cord: Astrocytes (GFAP) Ependimal cells Neurones Schwann Cells

48. Spinal cord Dorsal root Ventral root Epinevra Perinvra Endonevra Blood vessel Myeline Sensitory Fiber Neurilemme Motor Axone Sensitory Extremity motrice plaque Dissémination centrifuge de la PrPsc et contamination des plaques motrices musculaires

49. Accumulation de PrPsc dans le muscle chez le mouton infecté par l'ESB

50. Système nerveux + Amygdales Moelle épinière Sang Nœuds lymphatiques Nerf vague Plexus nerveux + Lymphe Rate Plaques de Peyer Muscle Voies de dissémination des prions (PrPsc), chez le mouton sensible:VRQ/VRQ, ARQ/ARQ OU ARQ/VRQ (et chez l’Homme atteint de MCJ « nouveau variant ») Cerveau Intestin