PENDAHULUAN KR OMATOGRAFI Oleh : Nina Salamah, MSc ., Apt.

1. PENDAHULUAN KROMATOGRAFIOleh :Nina Salamah, MSc., Apt. FakultasFarmasi UniversitasAhmad Dahlan

2. Menurut Willard et at, (1989), pembagian kromatografi dapat dibuat bagan sebagai berikut: Kromatografi KromatografigasKromatografiCair Gas-cairGaspadatCair-cairCair-padat (GLC) (GSC)LLC LSC EksklusifPenukarion EC IEC FaseterikatPasangan ion

3. Pembagian diatas berdasar jenis fase, ialah cair dan gas, • Pembagaian kedua :penukar ion dan eklusif serta pasangan ion hanya mengetengahkan salah satu fase diam, • Willard : kedua kromatografi penukar ion dan eklusif merupakan kromatografi yang berdasar pada interaksi antara linarut dan fase diam. • Berdasarkan kesetimbangan yang terjadi dibedakan menjadi 2 ialah: adsorbsi, dan partisi yang dapat terjadi baik dalam kromatografi gas maupun kromatografi cair.

4. Berdasarkan Proses Pemisahan • a. Kromatografi adsorbsi • b. Kromatografi partisi • c. Kromatografi pasangan ion • d. Kromatografi penukar ion • e. Kromatografi eksklusif • f. Kromatografi afinitas,

5. C.TEORI PEMISAHAN Teori dan Mekanisme dari berbagai pemisahan. 1. Pemisahan Adsorpsi • Peristiwa adsorpsi oleh fase diam terhadap fase gerak dan linarut selalu terjadi kompetitif • Kemampuan fase diammengadsorpsi keduanyasangat tergantung padatopografi gugus aktifyang terdapat pada masing -masing komponen. • Fase diam dari silica yang mempunyai gugas hidroksildari silanol (Si-OH)dapat terjadi interaksi dengan gugus pada linarut maupun pada fase gerak.

6. Peristiwaadsorbsiumumnya terjadi pada kromatografi padat cair (liquid solid chromatography, atau LSC, terjadi pada KLT). • Dapat pula terjadi pada Gas solid chromatography atau Kromatografi gas (KG) yang berinteraksi antara fase diam dan linarutnya. • Fase gerak pada kromatografi gas, tidak mempunyai gugus aktif yang dapat berinteraksi dengan fase diam.

7. Rumus Koefisien Distribusi (KD) • KD =CS/CM • CS menyatakan kadar linarut dalam fase diam (stationair phase),dan CM kadar linarut dalam fase gerak (mobile phase). • Persamaan diatas menunjukkan bahwa linarut X lebih banyak berinteraksi dengan fase diam karena indeknya lebih kecil dan jumlah dalam masing-masing fase juga sangat kecil. • Dengan pedoman tersebut berarti kadar linarut dalam fase diam selalu lebih kecil dari kadar linarut dalam fase gerak.

8. Berdasarkan hal di atas maka harga KD selalu lebih kecil dari 1, Tetapi mungkin dapat terjadi yang sebaliknya. • Adsorpsi linarut oleh fase diam sangat tergantungpada: a. Struktur kimia linarut atau adanya gugus aktif yang ada b. Ukuran partikel fase diam, makin kecil ukuran partikelfase diam makin luas permukaannya sehingga kontak dengan linarut makin luas. c. Kelarutan linarut dalam fase gerak, makin mudah larut linarut dalamfase gerak, linarutmakin mudah lepas dari fase diam.

9. d. Kemampuan interaksi (isotermik) yang terjadi antara fasediam dan fasegerak. Contoh interaksi antara beberapa senyawa aromatik dengan silica H O OH H O H O H O H O H O OH H O OH OH Si Si Si Si Si O O O O

10. Penggolongan tipe adsorbsi isotermik Peristiwaadsorbsiisotermikdapatdigolongkandalambeberapatipe yaitu : a.Tipekonkap terjadiapabilamula-mulalinaruttidakkuatinteraksinya. kemudianmenjadilebihkuatsehinggaterikat lama padafase diam. berarti K < 1 • b. Tipenormal(linier) Ikatanyang terjaditetap. Sehinggaberupagarislurusdan K = 1. • c. Tipekonvek, Adsorpsimula-mulaterikatkuat olehfesediam, makinlama makinlemahsehinggabentukkurvanyamenjadikonvekatauharga K>1

11. Penggolongan tipe adsorbsi isotermik • Puncak berekor Tipe a dan b tersebut yang sering menyebabkan terjadinya pelebaran puncak lihat gambar 3.2

12. Contoh gambar adsorbsi isotermik Gambar: Berekor/tailing Konveks Berekor/tailing Normal/bulat Normal/linier Normal/semitris Leading(pendahulu) Leading(pendahulu) Konkaf

13. a. Jenis fase diam • Fase diam untuk kromatografi adsorbsi yang paling banyak digunakan adalah silica gel • Partikel fase diam mempunyai bentuk dan ukuran yang berbeda. Ukuran makin kecil akan makin memperluas permukaan fase diam, dan memperluas pula gugus aktif dan fase diam yang aktif berhubungan dengan linarut • Bentuk dengan pori yang dalam, bila pori tersebut sangat banyak akan menaikkan harga K, yang jauh lebih besar dan 1 dan menimbulkan garis kurva adsorbsi isotermik yang konkaf

14. Makin dangkal pori yang ada, makin efisien untuk pemisahan. • Pedoman memilih fase diam dengan sebagai berikut: • 1).Fase diam yang bentuk pelikuler (pori yang dalam) akan menambah efisiensi, tetapimenaikkan kapasitasnya. • 2). Bentuk pelikuler umumnya dibuat packing dengan cara kering c= tidal berporus a=porus dangkal b=porus dalam

15. 3/. Bentukmikroporus, dikemassecarabasah (adonanatauslurry, permukaan jadi luas menambah harga K) • 4/. Bilapemisahanantaralinarutsukar,sebaiknyamenggunakanmikroporus, karenaefisiensinyamakintinggi, luaspermukaanpartikelmakinbesar, sehinggakontakdenganlinarutmakinbanyak (K menjadi besar). • Kejadiantersebutakanmenaikkansifatselektivitasfasediamterhadaplinarut, dankapasitasfasediamakanmenjadilebihbesar.

16. Tabel I.I Beberapanama adsorben/penjerapdanukurannya (Johson dan Stevenson 1979) HS =High solution HC=High capacity

17. 2. Pemisahan Partisi • Pemisahan cara partisi sangat erat kaitannya dengan kelarutan senyawa ke dalam pelarut. • Dalam kromatografi didasarkan pada kelarutan linarut dalam fase diam maupun fase cair, maka terdapat istilah koefisien partisi, yang peristiwanya akan mengembang menjadi koefisen distribusi yang umumnya berlaku pada kromatografi. • Koefisien partisi dapat dinyatakan sebagai perbandingan kadar(kelarutan) linarut dalam fase diam dengan kadar(kelarutan) linarut dalam fase gerak.

18. Sedangkansecaraumumadalahperbandingankelarutansenyawadalamoktanoldibandingkelarutannyadalam air. • Sifatlinarutdalamkromatografidapatdigambarkandalamberbagaicara, padakromatografikolomdikenaldengan volume tambatatau VR. • VR (sesuaidenganjumlah volume fasegerak yang digunakanuntukmembawasatulinarutkeluardarikolom). • TetapibiladinyatakandengantR (waktutambat) menyatakanwaktu yang diperlukanfasegerakmembawalinarutkeluardarikolom. c VR1 a VR2 b

19. Sedangkan waktu yang diperlukan untuk membawa linarut bergerak dari satu titik ke titik yang lain dalam KLT atau elektroforese disebut Rf. • Satuan ini merupakan perbandingan jarak yang ditempuh linarut dengan jarak yang ditempuh pelarut (fase gerak) dalam waktu yang sama Jarak migrasi sampel • Rf =  • Jarak migrasi pelarut • Tetapan partisi dengan inial k' (perbandingan kadar linarut dalam fase diam dibanding dengan kadar linarut dalam fase gerak). • Rumusnya adalah: seperti k’= CsVs/ (CmVm)

20. Kromatografi eksklusif pemisahannya atas dasar ukuran molekul linarut, utamanya pada molekul yang besar, sehingga dinamakan pula kromatografi filtrasi. • Pada kromatografi filtrasi dapat pula terjadi pada kromatogarfi gas tetapi dengan ukuran molekul yang kecil disebut moleculer shiever • Teori tersebut perlu dibahas terpisah sesuai dengan topik dan aplikasinya.

21. NCCH CH OCH CH CN(Normal) 3 2 2 2 CH (CH ) CH (Reverse) 3 2 16 3 LIQUID-LIQUID CHROMATOGRAPHY ODPN (oxydipropionylnitrile) Normal Phase LLC Reverse Phase LLC The stationary solid surface is coated with a 2nd liquid (the Stationary Phase) which is immiscible in the solvent (Mobile) phase. Partitioning of the sample between 2 phases delays or retains some components more than others to effect separation.

22. - + SO Na 3 ION-EXCHANGE CHROMATOGRAPHY Separation in Ion-exchange Chromatography is based on the competition of different ionic compounds of the sample for the active sites on the ion-exchange resin (column-packing).

24. Types of Ion Exchange Resins

25. Chromatography • Conditions associated with each kind of chromatography • Ion exchange chromatography • Organic cation exchange resins involve crosslinked polystyrene containing either SO3- or COO- functional groups with an associated cation • Organic anion exchange resin involve • crosslinked polystyrene containing NH3+ • functional groups with an associated anion The affinity of dissolved ions for the resin varies with the ion and the composition of the solution

26. nRzSO3–H+ + Mn+ (RzSO3)nM + nH+ • nRzCO2–H+ + Mn+ (RzCO2)nM + nH+ • nRzNR3+OH-+ An- (RzNR3)nA + nOH-

27. MECHANISM OF ION-EXCHANGE CHROMATOGRAPHY OF AMINO ACIDS pH2 - + + SO Na H N 3 3 COOH Ion-exchange Resin + - H N SO 3 3 - COO pH4.5 + Na

28. Chromatography of Amino Acids

29. Some Applications of Ion Exchange Chromatography • Purifications a mixed bed cation-anion exchanger remove salts (ex CaCl2) from water by exchanging them for H2O :Deionization of water • Concentrations The concentration of trace elements in seawater. • Analytical Separations Separations of metal ions and amino acid or halide ions

30. SIZE EXCLUTION CHROMATOGRAPHY Gel-Permeation Chromatography is a mechanical sorting of molecules based on the size of the molecules in solution. Small molecules are able to permeate more pores and are, therefore, retained longer than large molecules.

31. SIZE EXCLUTION CHROMATOGRAPHY • Molecules that can penetrate the gel particles are separated based on size and shape. Others pass straight through the column. • Gel filtration chromatography : mobile phase is water. • Gel permeation chromatography : mobile phase is an organic solvent. • Sephadex is popular molecular-sieve material 4 the separation of proteins.

32. Teori pemisahan • Pemisahan yang terjadi dalam sistem selalu mengalami keseimbangan yang dinamis, baik pemisahan tersebut karena peristiwa adsorbsi partisi, penukaran ion, permiasi, maupun cara afinitas. tR2 tR1 tm . . . . . . . 0 1 2 3 4 5 6 menit

33. Resolusi (Daya Pisah) • Kromatografi digunakan untuk analisis, tetapi tujuan utama semula adalah untuk pemisahan, sehingga dalam analisis campuranpun diutamakan pemisahannya. Untuk mendapatkan harga pemisahan yang dikehendaki berdasar pada rumus berikut: (tR2- tR2) R = ————— 0,5(W1+W2)syarat harga R agar terjadi pemisahan dengan baik paling tidak 1,25. Kalau hanya 1 masih ada tumpang tindih sebesar 2% antara puncak 1 dan puncak 2.

34. Applications of Chromatography • Qualitative Analysis • Quantitative Analysis • Analyses Based on Peak Height • Analyses Based on Peak Areas • Calibration and Standards • The Internal Standard Method • The Area Normalization Method