第 11 章吸光光度法

11.1 吸光光度法基本原理 11.2 吸光光度法的仪器 11.3 显色反应及影响因素 11.4 吸光度的测量及误差控制 11.5 吸光光度分析方法 11.6 吸光光度法的应用第11章吸光光度法

11.1 吸光光度法基本原理 光:一种电磁波,波粒二象性； 1单色光和复合光普朗克方程： E=hu=hc/l 单色光:具有相同波长的光；复合光:由不同波长的单色光组成的光；

2 互补色

3 物质对光的选择性吸收 当光子的能量与分子的E 匹配时，就会吸收光子。

吸收光谱曲线：物质在不同波长下吸收光的强度大小；A～l关系吸收光谱曲线：物质在不同波长下吸收光的强度大小；A～l关系最大吸收波长 lmax：吸光度最大值处对应的波长。吸收曲线的形状和lmax的位置取决于物质的分子结构。据此可进行定性分析。

It I0 Ir Ia 4 朗伯-比尔定律朗伯定律（1760年）：光吸收与溶液层厚度成正比； I0 = Ir + It + Ia I0 = It + Ia T = It / I0 , T: 透射比或透光度 A=lg (I0 / It )＝lg(1/T), A:吸光度比尔定律（1852年）：光吸收与溶液浓度成正比；

当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度及光程（溶液的厚度）成正比关系－－－朗伯比尔定律当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度及光程（溶液的厚度）成正比关系－－－朗伯比尔定律－－－光吸收定律数学表达：A＝lg(1/T)=Kbc 其中，A:吸光度，T:透射比， K:比例常数，b:溶液厚度，c:溶液浓度注意：平行单色光均相介质无反射、散射或光化学反应

灵敏度表示方法：摩尔吸光系数 c: mol/L A = ebc 摩尔吸光系数 ε A = Kbc c: g/L A = abc a: 吸光系数 e表示物质的浓度为1mol/L,液层厚度为1cm时，吸光物质对某波长光的吸光度。单位(L•mol-1 •cm-1)

桑德尔(Sandell)灵敏度： S 当仪器检测吸光度为0.001时，单位截面积光程内所能检测到的吸光物质的最低含量。单位：mg/cm2 S=M/e

50ml容量瓶中有Nb30μg，用2cm比色池，在650nm测定光吸收，A＝0.43,求S. (Nb原子量92.91)。＝3.3×104 L·mol-1·cm-1

在某一波长，溶液中含有对该波长的光产生吸收的多种物质，那么溶液的总吸光度等于溶液中各个吸光物质的吸光度之和。在某一波长，溶液中含有对该波长的光产生吸收的多种物质，那么溶液的总吸光度等于溶液中各个吸光物质的吸光度之和。 5、吸光度的加和性 A1 = e1bc1 A2 = e2bc2 A= e1bc1+ e2bc2 根据吸光度的加和性可以进行多组分的测定。

读出系统 光源单色器样品池检测器 11.2 吸光光度法的仪器 1 分光光度计的组成

常用光源

单色器 作用:产生单色光常用的单色器：棱镜和光栅样品池（比色皿）厚度(光程): 0.5, 1, 2, 3, 5…cm 材质：玻璃比色皿－－可见光区石英比色皿－－可见、紫外光区

检测器 作用：接收透射光，并将光信号转化为电信号。常用检测器：光电管光电倍增管光二极管阵列光电管分为红敏和紫敏，阴极表面涂银和氧化铯为红敏，适用625－1000nm波长；阴极表面涂锑和铯为紫敏，适用200－625nm波长。

目视比色法—比色管 光电比色法—光电比色计光源、滤光片、比色池、硒光电池、检流计分光光度法与分光光度计 722型分光光度计光学系统图 1.光源；2.滤光片；3,8聚光镜4,7.狭缝；5.准直镜；6.光栅 9.比色池；10.光电管

分光光度计的类型： 根据波长范围：可见分光光度计、紫外-可见分光光度计和红外分光光度计；根据仪器的结构与功能：单光束、双光束和双波长三种基本类型；

11.3 显色反应及影响因素 1 显色反应没有颜色的或颜色较浅的化合物，需要通过适当的反应定量生成有色化合物再测定－－显色反应；要求： a. 选择性好 b. 灵敏度高 (ε>104) c. 产物的化学组成稳定 d. 化学性质稳定 e. 反应物和产物有明显的颜色差别 (l>60nm) 对比度(Δλ):络合物最大吸收波长(λMRmax)与试剂最大吸收波(λRmax)之差。

2 显色反应类型 络合反应氧化还原反应

3 显色剂 无机显色剂: 过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾有机显色剂：生色团:含有π→π*跃迁的不饱和基团助色团:含非键电子的杂原子基团,如-NH2, -OH, -CH3… 偶氮类：偶氮胂III

三苯甲烷类 三苯甲烷酸性染料铬天菁S 三苯甲烷碱性染料结晶紫

形式 pH λmax(nm) 形式 pH λmax(nm) H4L+ 1.2 462-465 Sn4+ 1.0 530 H3L 4.8-5.2 462,490 Ga3+ 5.0 550 H2L- 8.4-9.0 512 HL2- 11.4-12.0 532-538 4 影响因素 • a 溶液酸度（pH值及缓冲溶液）影响显色剂的平衡浓度及颜色，改变Δl 影响待测离子的存在状态，防止沉淀；影响络合物组成 pH对苯芴酮及其络合物的颜色影响

b 显色剂的用量 c 显色反应时间针对不同显色反应确定显示时间显色反应快且稳定；显色反应快但不稳定；显色反应慢，稳定需时间；显色反应慢但不稳定 d 显色反应温度加热可加快反应速度，导致显色剂或产物分解

e 溶剂 有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率 f 干扰离子消除办法：控制酸度，加入掩蔽剂，改变价态选择合适参比褪色空白(铬天菁S测Al，氟化铵褪色，消除锆、镍、钴干扰) 选择适当波长

11.4吸光度的测量及误差控制 1、吸光度的测量条件的选择 1）测定波长选择选择原则：“吸收最大，干扰最小” 灵敏度选择性 2）测定浓度控制控制浓度吸光度A：0.2～0.8 减少测量误差

3）参比溶液选择 仪器调零消除吸收池壁和溶液对入射光的反射扣除干扰蒸馏水空白试剂空白

4）标准曲线制作 理论基础：朗伯-比尔定律相同条件下测定不同浓度标准溶液的吸光度A A～c 作图

光度分析法设计的步骤： 1. 选择显色反应 2. 选择显色剂 3. 优化显色反应条件 4. 选择检测波长 5. 选择合适的浓度 6. 选择参比溶液 7. 建立标准曲线测量条件选择

2、吸光光度法的误差 对朗伯-比尔定律的偏移：非单色光引起的偏移物理化学因素：非均匀介质及化学反应吸光度测量的误差

1 ）非单色光引起的偏移 复合光由l1和l2组成，对于浓度不同的溶液a和b,引起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复合光引起的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲。

2）物理化学因素 非均匀介质胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测吸光度增加，导致线性关系上弯化学反应离解、缔合、异构等如：Cr2O72-+H2O=2HCrO4-=2H++2CrO42- PAR的偶氮－醌腙式 3）浓度过高

11.5 吸光光度分析方法 1.经典光度分析法一、校准曲线法在确定的最佳显色反应条件和最佳测量条件下，分别测定一系列的不同浓度的标准溶液的吸光度，绘制A-C曲线。

二、示差吸光光度法 目的：提高光度分析的准确度和精密度；解决高(低) 浓度组分(i.e. A在0.2~0.8以外)问题分类：高吸光度示差法、低吸光度示差法、精密示差吸光度法特点：以标准溶液作空白原理： A相对= A = bcx- bc0= b c 准确度：读数标尺扩展, 相对误差减少, c0愈接近cx, 准确度提高愈显著。

三、解联立方程法 目的：对多组分的吸光物质的含量进行同时测定；原理：吸光度的加和性 Aλ1= Ax,λ1 + A y,λ1 = x, λ1 bcx +  y, λ1 bcy Aλ2= Ax,λ2 + A y,λ2 = x, λ2 bcx +  y, λ2 bcy

2.双波长吸光光度法 目的：解决浑浊样品光度分析消除背景吸收的干扰多组分同时检测原理： A = Aλ1 -A λ2 = （ λ1 -  λ2）b c 波长对的选择：等吸光度点法

例,苯酚与2,4,6-三氯苯酚(y)混合物中苯酚(x)的双波长分光光度法测定。例,苯酚与2,4,6-三氯苯酚(y)混合物中苯酚(x)的双波长分光光度法测定。选l1为参比波长, l2为测量波长得 Al1=  xl1bcx + yl1bcy Al2= xl2bcx+ yl2bcy ΔA=Al2-Al1= (xλ2bcx+yl2bcy)-(xl1bcx+yl1bcy) 在等吸光度的位置(G, F), yl2＝ yl1，则上式为 ΔA=(xl2- xl1）bcx ΔA与cx成正比, 可用于测定

AB- - A [H+][B-] pKa=pH+ lg Ka= A- AHB [HB] AB- - A lg A- AHB 11.6 吸光光度法的应用 1 测定弱酸和弱碱的离解常数 HB ＝H+ + B- [HB] pKa=pH+ lg [B-] AHB和AB-分别为有机弱酸HB在强酸和强碱性时的吸光度，它们此时分别全部以[HB]或[B-]形式存在。对pH作图即可求得pKa

2 络合物组成确定 饱和法（摩尔比法）制备一系列含钌3.0×10-5 mol/L (固定不变)和不同浓度（小于12.0×10-5 mol/L）的PDT溶液，按实验条件，485nm测定吸光度,作图。 PDT:Ru=2:1

等摩尔连续变化法 固定[M]+[L],改变[M],获得一系列吸光度值，吸光度最大的值所对应的[M]与[L]的比值，即获得M:L比值。 Co(III)与3，5－二氯－PADAT的比值为1:2

[MLn] K= [M][L]n 平衡移动法固定[M],不断改变[L]，以lg[MLn]/[M]为纵坐标，lg[L]为横坐标，作图，斜率n即是络合物中L:M的比值；纵轴上的截距lgK是络合物的稳定常数。 lgK+nlg[L]=lg([MLn]/[M]) lgK+nlg[L]=lgA/(Amax-A)

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