Bioelektrické jevy a jejich měření 3. přednáška

1. Bioelektrické jevy a jejich měření 3. přednáška

2. Elektrofyziologické měřící techniky a pomůcky A) Extracelulární snímání – historicky starší (neb „jednodušší“) Extracelulární snímání je založeno na registraci potenciálů nebo proudů a stimulaci vzhledem k referenční elektrodě pomocí elektrody umístěné mimo buňku, v její blízkosti. Používají se elektrody skleněné, kovové či uhlíkové. Lze tak snímat potenciály z jednotlivých buněk (neuronů, svalových vláken), proudy či změny koncentrace iontů v mezibuněčném prostoru (svalu, mozku), plošně potenciály z celých nervů, oddílu mozku či srdce a pod. Tyto snímací techniky neurčují dobře velikost klidového membránového či akčního potenciálu, nepotřebují ale tak složité doprovodné přístroje (zesilovače) jako snímání intracelulárními elektrodami s vysokým tzv. hrotovým odporem. B) Intracelulární snímání – problém vstupního odporu zesilovače Intracelulární snímání je založeno na registraci potenciálů nebo proudů a stimulaci vzhledem k referenční elektrodě pomocí skleněné mikropipetky se vsunutou Ag/AgCl elektrodou. Tato skleněná elektroda penetruje membránu buňky; musí být proto velmi tenká a ostrá, aby byl kontakt elektrody s membránou velmi těsný a buňka nebyla příliš poškozena (např. díry v membráně, kterými by tekly ionty). Skleněné mikroelektrody mají velmi tenký hrot, a díky tomu (a vlastnostem skla) také vysoký tzv. hrotový odpor. Proto musí být spojeny se zesilovači, jejich vstupní odpor je aspoň 100x vyšší než hrotový odpor pipetky (tím se chyba měření minimalizuje pod 1%). C) Terčíkový zámek (patch-clamp) – jak vyzrát na jeden jediný iontový kanál Registrace miniaturních proudů technikou terčíkového zámku je založena na přisátí ústí skleněné mikropipetky na buněčnou membránu. Díky různým konfiguracím pipetka/membrána lze provádět např. registrace pA proudů z kanálů v terčíků membrány vymezených ústím skleněné mikropipetky či registrace proudových odpovědí z celé buňky.

3. Mikroelektrody se užívají pro • zaznamenávání potenciálů (klidových, akčních) • aplikaci proudů a látek • zaznamenávání volných koncentrací různých látek (nabitých) v cytosolu, iontově selektivní záznamy Zaznamenávání potenciálů (klidových, akčních) a aplikace proudů jsou techniky, na kterých stojí celá klasická elektrofyziologie. Co je to mikroelektroda (ME)? Jedna z definic by mohla znít „elektroda vyrobená s hrotem o rozměru v řádu mikrometrů (10-6 m)“, tedy typicky skleněná mikropipeta navržená Lingem a Gerardem (1949), naplněná roztokem elektrolytu sloužícím jako vodič. A) Skleněné mikroelektrody(„Ag/AgCl elektrody ve skleněné mikropipetce“) Proč sklo? • sklo je dielektrikum, slouží jako izolant od okolí • dobře očištěné a odmaštěné sklo tvoří s lipidickou membránou velmi těsný spoj (minimální únik iontů okolo vpichu) Skleněné ME se vyrábějí ze skleněných kapilár tahem, během něhož jsou taveny. Když je sklo nahřáto tak, že je ještě plastické, ale už začíná chladnout, je tahem kapilára rozdělena na dvě půlky odlomené od sebe v hrotech. Vytáhnout elektrodu lze ručně, ale reprodukovatelné výsledky poskytují tzv. tahače.

4. tahače horizontální – produkují ME tahem nahřátých kapilár ve vodorovné poloze • - tahače typu Livingstone mají zpravidla tah kapiláry zajištěn pomocí soukolí ozubených koleček a jako zdroj tavícího tepla platinovou fólii (velmi jemné hroty ME s hrotovým odporem 30-300 MW, dlouhé skleněné „vlásky“) • tahače typu Brown-Flaming mají obvykle platinový nebo nichromový žhavící prvek a tah kapiláry zajištěn cívkami; vytahují ME v 1-2 krocích, některé mají i plynové trysky, které rychle žhavící prvek ochladí (jemné hroty ME s hrotovým odporem 300-500 MW, dobrá reprodukovatelnost, krátké „vlásky“, u neprogramovaných, manuálních typů někdy náročné nastavení tahače) • tahače vertikální mají jako žhavící prvek zpravidla nichromovou nebo platinovou smyčku a využívají v prvním kroku vytažení ME gravitaci, ve druhém je tah dokončen díky elektromagnetické cívce, jemné hroty ME s hrotovým odporem 30-40 MW veritkální tahač Narishige PC-10 horizontální tahač Narishige PN-30

6. Využití skleněných mikroelektrod Intracelulární snímání: - měření membránových potenciálů; tvaru, doby vzestupu a jiných parametrů AP; ploténkových potenciálů na nervosvalovém spojení (farmakologie: sledování vlivu různých farmak na hodnotu MP, na latence a velikost výlevu jednotlivých kvant na synapsi aj.); určování elektrických chrakteristik vzrušivých membrán a faktorů, které je ovlivňují - iontově selektivní ME (sledování změn koncentrací iontů, změn pH, určování cytoplasmatických koncentrací různých látek aj.) - aplikace proudových pulsů (stimulace) nebo různých (nabitých) látek - metoda patch clamp – zejména tzv. whole-cell (snímání z celé buňky) konfigurace jako nejsofistikovanější náhrada intarcelulárního měření Extarcelulární snímání: - extracelulární záznamy ploténkových proudů, odpovědí neuronů, studie vzorců aktivity neuronů (dobře lokalizováno místo snímání vizuálně – polohou hrotu ME)

7. Plnění skleněných mikroelektrod Po vytažení se skleněné ME dále upravují. Je třeba je naplnit vodivým či aplikačním roztokem a ME na patch-clamp tzv. polishovat. Polishování spočívá v lehkém otavení hrotu ME v blízkosti rozžahveného Pt drátku  spálí se případné elektrostaticky nachytané nečistoty a hrot ztratí ostré okraje vzniklé přelomením chladnoucího skla při tahu. Otisky hrotů polishovaných ME pod elektronovým mikroskopem. ME na patch-clamp jsou určeny k bezprostřednímu použití, ME např. na nervosvalové preparáty lze skladovat (naplněné, v chladu) řádově týden. Skleněné ME jsou obvykle plněny elektrolytem – roztokem nějaké soli. Složení daného elektrolytu závisí na typu experimentálního protokolu. Dnes nejužívanější způsob plnění je injikace elektrolytu do lumen ME, která je vyrobena z kapiláry se skleněným vláknem nataveným na stěně. Roztok je kapilárními silami vtažen až do hrotu ME a vznikající bubliny nejsou tak velké (neucpou lumen ME kompletně). Elektrolytem je nejčastěji 2,5-3 M KCl, často také 1-2% agar/0,15 M NaCl, formující tzv. solný můstek. Proč 2,5 M KCl? ME naplněné 2,5 M KCl uložené v lednici. K+ i Cl- mají podobné mobility. Navíc, při vysoké koncentraci KCl difunduje z ME (hydrostatický tlak 1-2 cm sloupce přes 2-5 mm hrot), takže solný můstek se neředí a nevznikají problémy s potenciálovým gradientem na pracovní elektrodě. Mezi pracovní a referenční elektrodou stejně vzniká koncentrační článek (Ec = RT/zF ln c2/c1), protože jsou v roztocích o různých koncentracích iontů 5 mM KCl vs. 2,5 M KCl. Dobré chloridování jej umenšuje. Plnění ME roztokem elektrolytu. Tenkou kanylou je ME roztokem naplněna, zbývá odstranit bubliny :), jinak by byl hrotový odpor ME nesmírně vysoký a ME by nebyla k ničemu ;)

8. Patchová ME na protoplastu. AgCl Ag+ + Cl- + e- - e- Skleněná mikroelektroda v akci musí být naplněná vodivým elektrolytem a spojena s přístroji – předzesilovači, zesilovači, osciloskopy, převodníky, stimulátory, počítači... a musí v ní být kovový vodič, spojený s kvalitními (měděnými) vodiči v těchto přístrojích. Ag/AgCl elektrody (nepolarizovatelné, reverzibilní vodiče 1. třídy), vyměňující elektrony za Cl- v roztoku • A) Stříbrné drátky pokryté vrstvou AgCl, používané jako pracovní i referenční elektrody • elektrolytické pochloridování (roztok HCl nebo KCl, křehká, ale jednotná vrstva AgCl) • Ag drátky ponořené do roztaveného AgCl • různá bělidla (Savo) Stimulační a registrační ME v hemidiafragmě. B) Ag pelety posypané AgCl (stabilní na světle, vedou hodně proudu, komerčně prodejné, pelety se vstrčí do ME) AgCl nedisociuje příliš ochotně a roztok je vůči němu vlastně nasycen. Vzhledem k tomu, že koncentrace Ag+ je nepřímo úměrná koncentraci Cl- a referenční elektroda je v roztoku o neměnné koncentraci KCl, neuvolňuje se z ní nijak masivně Ag toxické pro preparát. KCl vytékající z pracovní ME musí být z roztoku odstraňován perfuzí, aby např. nedepolarizoval preparát.

9. Laserem broušená wolframová ME. B) Kovové mikroeletrody Kovové ME jsou používány na extracelulární a na dlouhodobé záznamy. Velkou výhodou extracelulárních záznamů je to, že se ME nemusí zavádět do buňky, což může být velmi obtížné, je-li malá, a navíc ji to poškodí. Extracelulární záznamy jsou také výhodné u tkání, které se pohybují, mění objem a pod. Nevýhodou těchto záznamů je zejména to, že je velmi snadné pořizovat záznam z více buněk najednou, aniž to chceme, i když je hrot ME velmi malý (i pod 1 mm). Pak je třeba odlišit charakteristický projev jednoho neuronu od druhého (není snadné odlišit dva lidi v jedné místnosti plné jiných – amplituda?, frekvence?, tvar AP?,...). Extracelulárně zaznamenávané AP často leží těsně nad hranicí „šumu“ pozadí (nekoordinovaných náhodných výbojů, výtoky iontů apod.). ME vhodné k jejich zaznamenávání musí proto mít velmi nízký vlastní „šum“. Skleněné ME s k tomu nehodí – sklo je velice komplexní materiál a čím je hrot ME tenčí a delší, tím víc sklo interaguje s ionty v roztoku (hrotový potenciál ME přispívající k naměřeným hodnotám potenciálů), hrot má též vysoký odpor a ME hodně „šumí“. Kovové ME tento problém nemají, zato na rozhraní kov/vodný roztok dochází k oxidacím, mohou vznikat bublinky plynu (s kapacitou, která ovlivní měřené napětí i proud) – proto nejsou kovové ME vhodné k intracelulárnímu měření. Kovové ME mohou být používány opakovaně, jednotlivě i jako stereody (dvě spojené), koncentrické ME, multielektrodové systémy apod. Nejčastěji jsou vyrobeny z wolframu, směsi platiny a iridia, čisté platiny, Sčistého iridia a nerezové oceli. Podobné využití jako kovové ME mají i ME z uhlíkových vláken, které se snadněji vyrábějí, jsou dobrými vodiči a mají nízký šum na rozhraní s elektrolyty.

10. + pól - pól kyanid 5 mm Kovové ME jsou používány na extracelulární a na dlouhodobé záznamy. Dnes víceméně bez vyjímky komerční (slitina wolframu; Pt, Ir), dříve home-made výroba elektrody a její následná izolace. Drátek (ocel, Pt/Ir) nastříhán na patřičnou délku. upevněn do držáku a galvanicky naostřen napětím v řádu voltů. Elektrody po obvodu držáku se rovnoměrně otáčení a postupně se zužují v periodicky ponořovaných částech. V místě hladiny je ME nejmíň času, čím dále od hladiny, tím je při otáčení v lázni déle. Takto nabroušené ME je třeba následně elektricky izolovat. • komerční kovové ME jsou lakovány izolačním lakem pokrývajícím ME až ke hrotu, ten je neizolován v délce asi 10 mm (čím je neizolovaný hrot kratší, tím je ME přesnější co do lokalizace sledovaného místa); jiné typy izolace zahrnují pokrytí polyimidy, Parylenem; polarizace těchto elektrod se mění v průběhu experimentu, často nepredikovatelně  spíše krátkodobější měření; typické použití – sledování elektrické jednotkové aktivity mozku); odpor typicky kW či jednotky MW • izolace sklem – jako žhavící prvek slouží Pt plíšek s prohnutou jamkou Do jamky se nasype borosilikátové sklo, do roztaveného skla se zanoří elektroda a pokryje se asi do 2 cm délky, hrot nezaizolován; odpor těchto ME je řádově jednotky megaohmů.

11. Kovové ME jsou používány na extracelulární a na dlouhodobé záznamy. Typická kovová ME – W, délka 76 mm, izolant silný 1 mm, odpor 1MW (20%!), hrot 1 mm; užití – nahrávky z jednoho a více neuronů a z malých buněk ležících těsně u sebe, mikrostimulace, penetrační ME, deep-brain studies Stereody – studie založené na bipolární stimulaci malých lokalizovaných částí nervové tkáně, simultánní nahrávky dvou neuronů ležících u sebe Koncentrické ME – studie dlouhodobé, nahrávky z větších oblastí a nahrávky evokovaných potenciálů, bipolární stimulace; W ME o průměru 75 mm, hrotu 1-2 mm a odporu 10-15 kW; vnější vodič je jehla z neroezové oceli (referenční elektroda); při zavádění se nejprve udělá průchod mozkovými plenami a posléze stereotakticky napolohuje ME Multielektrodové systémy – chronicky implantovatelné multiME sety, mikrodrátkové sety na dlouhodobé stimulace

12. Multielektrodové systémy – chronicky implantovatelné multiME sety, mikrodrátkové sety na dlouhodobé stimulace, snímání či stimulace z in vivo preparátů, z tkáňových kultur „Manžety“ (ME for nerve cuffs) s elektrodami k dlouhodobým záznamům a/nebo stimulaci izolovaných nervů in situ (př. studium neuronů řídících dýchání: odkrytá prodloužená mícha pokrytá minerálními oleji; savčí periferní nervy – manžety s typickým průměrem 3 mm; většina myelinizovaných vláken – manžety s dstupem elektrod 5 mm) Plošně (na dně kultivační Petriho misky) umístěné elektrody určené ke snímání nebo ke stimulaci z tkáňových kultur neuronů nebo myotub.

13. Plošně (na dně kultivační Petriho misky) umístěné elektrody určené ke snímání nebo ke stimulaci z tkáňových kultur neuronů nebo myotub.

14. uhlíkové vlákno skleněná kapilára uhlíkové vlákno kapilára mikropinzety zkumavka aceton C) Mikroeletrody z uhlíkových vláken Vyvinuty na konci 70. let jako pokus o řešení mikroiontoforetických aplikací a současných záznamů z tkání. Výhody: jsou lacinné (svazky mnoha set vláken o průměru 7-8 mm), dobře vedou a mají nízký šum, vyrábí se snadněji než W ME. Nevýhody: jsou křehčí, mají uniformní průměr bez tvarovatelně ostřeného hrotu, nedají se příliš používat opakovaně Použití: voltametrická analýza výlevu neuropřenašečů in vivo (výlev dopaminu po stimulaci dopaminergních nigro-striatálních neuronů v nc. caudatus), redox potenciály oxidovaných látek v buňkách aj. Home-made: jedno ze zakoupeného svazku vytažené vlákno, kapilára naplněná acetonem  odsátím acetonu vlákno naadheruje na stěnu kapiláry (povrchové napět)  vytažení skleněné ME na tahači, zkrácení vyčnívajícího vlákna  odizolování tenkého (měděného) vodiče  izolace jednoho z drátků  ponoření drátku do lepící pasty se stříbrem  vsunutí do skleněné kapiláry  kontakt s uhlíkovým vláknem Pro nahrávání s extra nízkým šumem lze ještě uhlíkový hrot (pro extracelulární záznamy má typicky délku 10-30 mm) pochloridovat ponořením hrotu do roztaveného nitrátu stříbra (0,05 M) a aplikací asi 10 A proudových pulsů ( Ag), následně ponořením do fyziologického roztoku ( AgCl).

15. Pohled na povrch uhlíkové ME ve skenovacím elektronovém mikroskopu (zepředu a z boku). Uhlíkové vlákno bylo odstřiženo pod úhlem cca 45°. Vlákna Thornel P55, Amoco, Greenville, SC, USA. Příklad záznamu uhlíkovou ME. Jednotlivé hroty představují výlevy jednotlivých měchýřků obsahujících 5-hydroxytryptamin v preparátu zmyších peritoneálních mastocytů. Výlev byl navozen aplikací 0.5 mM roztoku Ca2+ ionoforu A23187. Je to klasická voltametrická analýza (scan rate 800 V.s-1) – proud byl zaznamenáván při maximální oxidaci 5-HT na +550 mV.

16. pravoúhlé pulsy podkompenzováno překompenzováno Měřící systémy(předzesilovače, zesilovače, stimulační jednotky, zdroje...) • Každý měřící systém musí • co nejpřesněji měřit daný parametr (napětí, proud...) • musí vlastnosti daného parametru co nejméně poškozovat Experimentální protokol často vyžaduje manipulace s membránovým potenciálem buňky (např. při měření pasivních vlastností membrány, jako je vstupní odpor rinput, aplikací proudu). Zpravidla se k tomu používají dvě elektrody: jedna záznamová (recording) a druhá aplikační (current passing). Hodnotu naměřeného potenciálu ovlivňuje řada faktorů. Velkou roli hrají kapacity (mezi pracovními ME a uzemněním): kapacita membrány buňky, kapacita ME a roztoku... Částečně lze pomoci např. ME s tenkými stěnami nebo nízkou hladinou roztoku v měřící komůrce, ale obecně je třeba tyto napěťové ztráty kompenzovat. Děje se tak mj. pomocí zpětnovazebných obvodů produkujících proud ztracený celkovými kapacitními ztrátami.

17. Měřící systémy 21. století  digitálně-analogový převodník Digidata 1440A+softwarový balík pClamp 10 nízkošumový zesilovač Axopatch 200B + Pracovní stanice OpusXpress 6000A:provádí automatizovaný voltage-clamp screening až na osmi kanálech současně; pracuje na oocytech. Zavedení elektrody do oocytu, výměny roztoků, sběr dat a jejich real-time analýzu provádí automaticky pod PC kontrolou. Pracovní stanice PatchXpress 7000A:automatizovaná a poměrně flexibilní; pracuje až se 16 buňkami současně, whole-cell konfigurace pro přímý záznam aktivity iontových kanálů Patch Clamp na skleněných mikročipech:do jamky se nanese suspenze buněk, ty sedimentují na pásek planárních elektrod, systém vybere tu pozičně nejvhodnější; reprodukovatelná měření nevyžadující zvláštní schopnosti experimentátora; mikrolitry roztoku s perfúzí i méně než 10 ms, i perfúze intracelulární

18. Ct... transmurální kapacita elektrody ME s tenkými stěnami nebo nízkou hladinou roztoku v měřící komůrce Cs... kapacitní ztráty díky uzemnění ME, zesilovače/ů aj. Ca... vstupní kapacita zesilovače/ů Obvod kompenzující potenciálové ztráty během aplikace proudového pulsu. Kompenzace pomocí zpětnovazebných obvodů produkujících proud ztracený celkovými kapacitními ztrátami. Dobrá kompenzace závisí na rychlosti, s jakou je zpětnovazebný obvod schopný produkovat patřičné proudové pulsy. Je tedy dobré (i) co nejvíc minimalizovat ztráty způsobené Ct a Cs a (ii) používat řídící zesilovače s rychlým rise-timem (dobou vzestupu amplitudy pulsu).

19. Unaveni? VYDRŽTE!

20. Napěťový zámek (voltage clamp) Napěťový zámek je metoda vynalezená Kenethem Colem a Curtisem a zdokonalená Hodgkinem, Huxleyem a Katzem. Dovoluje „nastavit“ membránový potenciál buňky na určitou hodnotu (mV) a „zamknout“ jej na této úrovni, přičemž lze zaznamenávat proudy tekoucí přes membránu dané buňky. V buňce tedy máme dvě skleněné ME: jedna zaznamenává proud a druhá udržuje patřičný transmembránový potenciál. Jedna ME zaznamenává transmembránové napětí (a toky proudů) oproti zemnící elektrodě umístěné extracelulárně a je připojena na zesilovač. Druhá ME je připojena ke zdroji napětí a je na ni nastaveno tzv. řídící napětí, tj. úroveň potenciálu, na které má být „uzamčena“ membrána. Pokud se liší hodnota tohoto řídícího napětí a membránového potenciálu měřeného první ME, vyšle zdroj proudový puls, který tyto hodnoty zase srovná. Takže: je-li řídící napětí nastaveno na hladinu klidového membránového (např. –60 mV) potenciálu a změřený potenciál je -60 mV, není třeba aplikovat žádný proud. Pokud je řídící napětí nastaveno např. na –40 mV, zesilovač odpoví aplikací takového proudu, aby membránu depolarizoval z –60 mV na požadovaných –40 mV. Takto dojde mj. k otevření napěťově ovládaných sodíkových kanálů, sodné ionty vtékají do buňky a nesou tak dovnitř tekoucí proud. U nezamčeného vlákna by vtékaly sodné ionty dál a dál (snaha dosáhnou ENa), ale u vlákna zamčeného zesilovač operativně vyšle opačný proudový puls v takové výši, aby udržel membránu na požadovaném řídícím napětí. Velikost dovnitř tekoucího sodíkového proudu a opačného proudu aplikovaného zesilovačem je naprosto stejná. Metoda napěťového zámku tedy umožňuje měřit velikosti proudů nutných k dosažení určitého membránového potenciálu. Spolu se specifickými blokátory různých typů kanálů můžeme také např. určit typ proudu za danou odpověď zodpovědného a pod. Tato technika umožnila Hodgkinovi s Huxleyem analyzovat jednotlivé fáze akčního potenciálu co do typu proudů.

21. Tato technika umožnila Hodgkinovi s Huxleyem analyzovat jednotlivé fáze akčního potenciálu co do typu proudů. Do obřího axonu sépie zavedli dva drátky. Jeden sloužil jako záznamová elektroda k registraci transmembránového potenciálu, druhý sloužil k aplikaci proudů nutných k udržování řídícího napětí. Metoda napěťového zámku tedy umožňuje měřit velikosti proudů nutných k dosažení určitého membránového potenciálu. Spolu se specifickými blokátory různých typů kanálů můžeme také např. určit typ proudu za danou odpověď zodpovědného a pod.

22. Vně 10 0 Uvnitř -10 Vně 10 Membránové proudy (nA) 0 0 0 0 5 5 5 10 ms 10 ms 10 ms Uvnitř -10 Vně 10 0 Uvnitř -10 Membránové proudy (nA) TTX TEA Membránové proudy (nA) Farmkologické oddělení různých proudů pomocí voltage clampu Mějme žabí myelinizovaný nerv uzamčený na membránovém potenciálu 0 mV. Dojde k otevření napěťově ovládaných sodíkových kanálů, sodné ionty vtékají do buňky a nesou tak dovnitř tekoucí proud. Se zpožděním se otevírají draslíkové kanály, draslík vytéká z buňky a nese tak ven tekoucí proud. U nezamčeného vlákna by vtékaly sodné i draselné ionty dál a dál (snaha dosáhnou ENa a EK), ale u vlákna zamčeného zesilovač operativně vyšle opačný proudový puls v takové výši, aby udržel membránu na požadovaném řídícím napětí (0 mV). Toky proudů můžeme souhrnně zaznamenat: TTX specificky blokuje sodíkové kanály. Po přidání 300 nM TTX do roztoku vymizí sodíkové proudy a zůstanou jen draslíkové: TEA specificky blokuje draslíkové kanály. Po přidání 10 mM TEA do roztoku vymizí draslíkové proudy a zůstanou jen sodíkové:

23. ENa membránový potenciál (mV) mS/cm2 EK Podobným postupem Hodgkin a Huxley „rozložili“ akční potenciál na příspěvky jednotlivých typů proudů (postupným „zamykáním“ membrány na různé hodnoty membránového potenciálu a analýzou toků jednotlivých proudů při těchto potenciálech). Zrušili tím definitivně ani ne půl století starou membránovou teorii Julia Bernsteina a prokázali, že během akčního potenciálu dochází díky tokům sodíkového proudu k překmitu membránového potenciálu do kladných hodnot. „It´s the squid that really ought to be given the Nobel Prize.“ A.L.Hodgkin čas (ms)

24. Terčíkový zámek (patch clamp) Terčíkový zámek je metoda Erwinem Neherem a Bertem Sackmanem v letech 1976-1981, NC 1991. Princip: přisátí na konci otavené skleněné ME k buněčné membráně. Díky přilnavosti lipidů k čistému sklu vznikne velmi pevné spojení (vyšší než soudržnost membrány samotné!). Ústím pipety (2-4 µm) je vymezen malý terčík (patch). Metoda je vhodná jen pro buňky zbavené buněčné stěny či bazální membrány. Různé konfigurace: A) „přisátí k buňce“ (cell-attached configuration: po přiblížení k buňce lze aplikací mírného podtlaku (sání) vtáhnout část membrány do ústí pipety (gigaseal, 10-50 GW); registrace aktivity jednotlivých kanálů v terčíku při přirozeném membránovém potenciálu buňky B) „snímání z celé buňky“ (whole-cell configuration: aplikací dalšího podtlaku lze terčík protrhnout, membrána se přilepí na vnitřní povrch ME; stejný potenciál aplikovaný v pipetce jako KMP buňky, nízká koncentrace Ca2+ v pipetce; souhrnný proud vzniklý činností všech kanálů v membráně buňky C) „snímání z terčíku“ (inside-out, outside-out configuration): terčík v ústí pipety lze odtrhnout (intracelulární strana membrány do roztoku, inside-out), nebo lze pipetu jemně a s ní i membránu vytahovat: poté, co se krček přetrhne, membrána se zase spojí (outside-out) D) perforated-patch configuration: terčík v ústí pipety přisáté k buňce (viz A) lze „proděravět“ přidání ionoforů do roztoku v pipetě; amfotrecin nebo nystatin vytvoří umělé kanály v membráně, přes které ale z buňky neuniknou větší částice

25. Patch-clamp na stínítku osciloskopu El. odpor při úspěšném přisátí vzroste na gigaohmy a velikost protékajícího proudu klesne na minimum. Zkreslení kpacitních proudů lze zesilovačem odstranit / snížit na minimum. Při protržení terčíku (whole-cell) se odpor sníží, kapacitní proudy vzrostou (nabíjí se terčík, elektroda) a obsah buňky je vymyt roztokem z pipety.

26. The top trace on the osciloscope screen is the current response of the electrode in the bath. The bottom trace shows the small voltage step that is being applied repeatedly. As the seal begins to form, the horizontal lines of the current trace move closer together. The current response when the pipette is on the cell and a seal has begun to form is detectable as a spread line. Tobby is gently sucking on the back of the syringe that is connected to the back of the pipette. This suction will help seal the tip of the pipette onto the cell. Subsequently, you can see the current response to a series of small voltage steps when the pipette has formed a tight seal on the cell membrane. The vertical "spikes" in the current trace are currents due to the pipette capacitance. The amplifier is used to compensate, i.e. to electronically remove, the pipette capacitance from the current recording. After electrically removing the pipette capacitance, the vertical spikes are gone. To break into the whole cell recording mode, additional suction is applied to the syringe. As shown here, you'll know when a whole cell recording in acheived because the capacitative transients (the vertical "spikes" due to the cell capacitance) are large and have a slow decay.

27. Co si pamatovat z dnešní přednášky • specifiky extracelulárního, intracelulárního snímání a patch clampu • využití skleněných, kovových a uhlíkových mikroelektrod • princip napěťového zámku (voltage clampu) • využití napěťového zámku (Hodgkin a Huxley) • princip a jednotlivé modifikace terčíkového zámku (patch clampu) • využití terčíkového zámku (patch clampu)