ZAŠTITNO DJELOVANJE MOKRAĆNE KISELINE NA OKSIDACIJSKI STRES I ELASTIČNOST ARTERIJSKE STIJENKE

1. ZAŠTITNO DJELOVANJE MOKRAĆNE KISELINE NA OKSIDACIJSKI STRES I ELASTIČNOST ARTERIJSKE STIJENKE Doktorska disertacija Jonatan Vuković, dr. med. Mentor doc. dr. sc. Darko Modun

2. UVOD Hiperoksija i antioksidansi • Kisik se kao terapijsko sredstvo rabi u različitim hitnim medicinskim stanjima • Često se primjenjuje bez znanja o arterijskoj saturaciji oksihemoglobina, pa pacijenti mogu biti izloženi hiperoksiji • Hiperoksija uzrokuje vazokonstrikciju, te smanjuje elastičnost arterijske stijenke

3. Pretpostavljeni mehanizam poremećaja krvožilne funkcije izazvanog hiperoksijom

4. Terapijska strategija • Kao terapijska strategija protiv slobodnih radikala predložena je primjena antioksidansa • Do sada je primjenjivan vitamin C kao terapijsko sredstvo protiv slobodnih radikala nastalih hiperoksijom

5. Mak i suradnici su zdravim dobrovoljcima i pacijentima s kongestivnim srčanim zatajenjem davali 100% kisik20 min. Am J Physiol Heart circ Physiol 2002; 282:H2414-21 • davajući vitamin C (intraarterijska aplikacija za vrijeme izlaganja kisiku, 24 mg/min vitamina C tijekom 5 min.) spriječili su vazokonstrikciju izazvanu hiperoksijom i smanjili pogoršanje vazodilatacije ovisne o endotelu u bolesnika s kroničnim srčanim zatajenjem i u zdravih ljudi

6. Am J Physiol Heart circ Physiol 2002; 282:H2414-21

7. Mc Nulty i suradnici su pacijentima sa ishemijskom bolesti srca davali 100% kisik 10 minuta J Appl Physiol 2007; 102:2040-5 • Time su reducirali brzinu koronarnog protoka za 20%, a povećali koronarni otpor za 23% • Primjena vitamina C (3 gu intravenskoj infuziji kroz 15 min.) obnovila je brzinu koronarnog protoka i smanjila koronarniotpor

8. Učinci drugih antioksidanasa, pa tako i mokraćne kiseline, na oksidacijski stres i promjenu krvožilne reaktivnosti izazvane hiperoksijom do sada nisu ispitani na ljudima

9. FIZIOLOŠKA ULOGA MOKRAĆNE KISELINE PRI IZLAGANJU HIPEROKSIJI?

10. Hilliker i suradnici su pokazali da su mutanti mušice Drosophila melanogaster, koji su izgubili sposobnost sinteze mokraćne kiseline, osjetljiviji na hiperoksiju (Proc. Nati. Acad. Sci. USA Vol. 89, pp. 4343-4347, May 1992 Genetics) (Proc. Nati. Acad. Sci. USA Vol. 89, pp. 4343-4347, May 1992 Genetics)

11. Mokraćna kiselina kao antioksidans • Mokraćna kiselina je proizvod metabolizma purina, za koji se dugo vremena mislilo da je inertan • U većine sisavaca mokraćna kiselina se razgrađuje s pomoću urikaze u alantoin • Posljedica mutacija u ljudi i viših primata je povećana koncentracija mokraćne kiseline

12. JPET 324:1–7, 2008

13. Ames i suradnici su pretpostavili da je mokraćna kiselina antioksidacijska zamjena za gubitak sposobnosti sinteze vitamina C u viših primata Proc natl Acad Sci USA 1981; 78:6858-62 • S tom mutacijom povezano je produženje životnog vijeka • Mokraćna kiselina je najzastupljeniji antioksidans u plazmi i predstavlja oko 60% ukupnog antioksidacijskog kapaciteta plazme Proc natl Acad Sci USA 1981; 78:6858-62, Anal Biochem 1996; 239:70-6

14. Mehanizmiantioksidacijskog djelovanja mokraćne kiseline • Mokraćna kiselina je čistač (eng. scavenger) slobodnih radikala (Maples KR et al.J Biol Chem 1988;263:1709-12.REF) • Kelira prijelazne metale kao što su željezo i bakar (Davies KJ et al.Biochem J 1986;235:747-54.; Sevanian Aet al. J Free Radic Biol Med 1985;1:117-24.) • Odstranjuje peroksinitrit stvarajući molekulu koja je stabilni donor dušikovog oksida in vitro (Skinner KA et al. J Biol Chem 1998; 273:2449-7)

15. Akutno povišenje koncentracije mokraćne kiseline u plazmi: • povećava antioksidacijski kapacitet plazme (Waring WS, J Cardivasc Pharamac 2001) • popravlja endotelnu funkciju u bolesnika s diabetesom melitusom tipa I i u kroničnih pušača (Waring WS, Diabetes 2006) • smanjuje oksidacijski stres izazvan tjelovježbom (Mikami T, Free Radic Res 2000; Waring WS, Clin Sci 2003)

16. Akutno povišenje koncentracije mokraćne kiseline u plazmi: • Waring i suradnici su za povišenje mokraćne kiseline koristili intravensku infuziju mokraćne kiseline u količini od 1000 mg/60 min.(Waring WS, J Cardivasc Pharamac 2001) (Waring WS, Diabetes 2006) ili 500mg/20 min.(Waring WS, Clin Sci 2003) • Mikami i suradnici su u svojoj studiji mokraćnu kiselinu povisili oralnom primjenom 10 g inozin 5‘-monofosfata (IMP)(Mikami T, Free Radic Res 2000)

17. Specifičnost istraživanja: • neinvazivni pristup akutnom povišenju mokraćne kiseline u plazmi, i to konzumirajući različite napitke kao što su crno vino, etanol + glicerol i otopina fruktoze • pozitivan učinak mokraćne kiseline postigao bi se s 15-20% povišenjem mokraćne kiseline, u odnosu na 60-100% povišenje njezine koncentracije u prethodnim studijama (Waring WS, J Cardivasc Pharamac 2001, Waring WS, Diabetes 2006, Waring WS, Clin Sci 2003, Mikami T, Free Radic Res 2000)

18. PROBLEMATIKA I CILJ ISTRAŽIVANJA • Istražiti učinak akutnog umjerenog povećanja koncentracije mokraćne kiseline u plazmi na elastičnost arterijske stijenke i na markere oksidacijskog oštećenja u plazmi zdravih dobrovoljaca nakon izlaganja 100% normobaričnom kisiku

19. PROBLEMATIKA I CILJ ISTRAŽIVANJA • Razlučiti učinke induciranog povećanja mokraćne kiseline u plazmi od učinaka vinskih polifenola i etanola na elastičnost arterijske stijenke i na markere oksidacijskog oštećenja u plazmi kod zdravih dobrovoljaca nakon izlaganja 100% normobaričnom kisiku primjenom crnog vina, etanolai glicerola te fruktoze

20. HIPOTEZE ISTRAŽIVANJA • akutni umjereni porast mokraćne kiseline izazvan unosom: a) crnog vina, b) kombinacije etanola i glicerola te c) fruktoze smanjit će oksidacijsko oštećenje nastalo kao posljedica prethodno inducirane hiperoksije

21. HIPOTEZE ISTRAŽIVANJA • akutni umjereni porast mokraćne kiseline u plazmi, izazvan unosom prije navedenih napitaka, spriječit će hiperoksijom potaknuto sniženje elastičnosti arterijske stijenke, neovisno o vinskim polifenolima i etanolu

22. HIPOTEZE ISTRAŽIVANJA • akutni umjereni porast mokraćne kiseline u plazmi, izazvan unosom prije navedenih napitaka, spriječit će hiperoksijom potaknuti porast koncentracije markera oksidacijskog oštećenja u plazmi, neovisno o vinskim polifenolima i etanolu

23. SADRŽAJ ISTRAŽIVANJA • 10 zdravih muškaraca nepušača bilo je uključeno u pokus • Vrijednosti art. tlaka, glukoze, kolesterola i mokraćne kiseline – normalne • Unos ispit. napitaka na tašte - 3 ml/kg tj.m. • Ukriženi pokus, 1 posjet tjedno, 4 posjeta

24. PROKOL ISTRAŽIVANJA • Zdravim dobrovoljcima se uzorkovala krv i mjerena je elastičnost art. stijenke na početku pokusa, prije unosa, i u 60., 90., 120., 150. i 240. minuti nakon unosa vode, crnoga vina, kombinacije etanola i glicerola ili otopine fruktoze • Primjena 100% normobaričnog O2 (60.-90. min) • Antioks. kap. plazme, markeri oks. stresa, mokr. kiselina, elastič. arterijske stijenke, etanol

27. METODE ISTRAŽIVANJA Izrada ispitivanih pića • Crno vino, Vinagra 2005., 13% etanola • Kombinacija etanola i glicerola, 13% etanol i 8 g/l glicerola • Otopina fruktoze, 80 g fruktoze u 300 ml vode • Voda

28. Način povećanja konc. mokraćne kis.u plazmi: • Konzumacija crnog vina (Modun et al. Atherosclerosis 2008;197:250–6, Modun et al. Clin Chem 2006;52:785-7) • Konzumacija kombinacije etanola i glicerola (Modun et al. Clin Chem 2006;52:785-7) • Konzumacija otopine fruktoze (Lotito and Frei, FRBM, 2006)

29. METODE ISTRAŽIVANJA Analiza plazme • Za određivanje antioksid. kapaciteta plazme koristila se metoda FRAP koja se zasniva na redukcijskoj sposobnosti uzorka (Benzie IF et al. Anal Biochem 1996;239:70-6. )

30. METODE ISTRAŽIVANJA Analiza plazme • Za određivanje koncentracije lipidnih hidroperoksida (LOOH) rabila se metoda FOX koja se temelji na oksidaciji Fe+2 u Fe+3 s pomoću LOOH (Gay CA et al. Anal Biochem 2002;304:42-6.; Arab K et al. Anal Biochem 2004;325:158-63.) • Za određivanje koncentracije lipidnih peroksida (LOO-) rabila se metoda TBARS koja se temelji na reakciji MDA, jednog od produkata lipidne peroksidacije, s tiobarbiturnom kiselinom (TBA) (Esterbauer H et al. Methods Enzymol 1990;186:407-21; Lapenna D et al. Free Radic Biol Med 2001;31:331-5)

31. METODE ISTRAŽIVANJA Analiza plazme • Za određivanje koncentracije mokraćne kiseline u plazmi koristili su se rutinski biokemijski kitovi • Za određivanje koncentracije etanola u krvi rabila se plinska kromatografija (GC)

32. METODE ISTRAŽIVANJA Određivanje kardiovaskularnih parametara • Za određivanje arterijskog tlaka i srčane frekvencije koristio se Arteriograph • Za mjerenje elastičnosti arterijske stijenke, koju onda izražavamo preko augmentacijskog indeksa, korištena su dva aparata, SphygmoCor i Arteriograph (J Hypertens 1998;16:2079-84. J Hypertens 2008;26:523-8. )

33. METODE ISTRAŽIVANJA Određivanje elastičnosti arterijske stjenke • Augmentacijski indeks (Aix) neizravni je pokazatelj arterijske elastičnosti koju određujemo mjereći valnu refleksiju • Aortalni pulsni val sadržava početni (sistolički) i reflektirani val. Učinak valne refleksije na vrh aortalnog sistoličkog tlaka može se opisati kao augmentacija

34. Augmentacijski indeks ustvari predstavlja razliku tlakova između sistoličkog (P1) i reflektiranog vala (P2) u odnosu na tlak pulsa (PP) te se izračunava prema sljedećoj formuli: Aix (%) = [(P2-P1)/PP] × 100

35. STATISTIČKE METODE • Korištena je dvosmjerna analiza varijance za ponovljena mjerenja, te ako se utvrdila statistička značajnost, Bonferonni test za post hoc analizu • Za procjenu povezanosti različitih izmjerenih parametara korišten je Pearsonov koeficijent korelacije • p<0,05 predstavlja granicu statističke značajnosti

36. ETIČNOST POSTUPKA • Svi navedeni eksperimentalni postupci su odobreni od strane Etičkog povjerenstva Medicinskog fakulteta u Splitu • Potpisan je obrazac o informiranom pristanku od strane svakog ispitanika

37. REZULTATI

38. Učinak unosa napitaka na augmentacijski indeks ispitanika Promjene u perifernom augmentacijskom, indeksu nakon konzumiranja testiranih napitaka i primjene kisika. Aix vrijednosti su mjerene prije i nakon 60, 90, 120, 150 i 240 minuta nakon konzumacije crnog vina (∆), etanola+glicerola (▼), fruktoze (◊) i vode (■).

39. Učinak unosa napitaka na koncentraciju lipidnih peroksida Promjene u biokemijskim markerima oksidacijskog stresa: plazmatskih lipidnih peroksida (LOO-) nakon konzumacije napitaka i primjene kisika . LOO- vrijednosti mjerene su prije i nakon 60, 90, 120, 150 i 240 minuta nakon konzumacije crnog vina (∆), etanola+glicerola (▼), fruktoze (◊) i vode (■).

40. Učinak unosa napitaka na koncentraciju lipidnih hidroperoksida u plazmi Promjene u biokemijskim markerima oksidacijskog stresa lipidnih hidroperoksida (LOOH) nakon konzumacije napitaka i primjene kisika . LOOH vrijednosti mjerene su prije i nakon 60, 90, 120, 150 i 240 minuta nakon konzumacije crnog vina (∆), etanola+glicerola (▼), fruktoze (◊) i vode (■).

41. Učinak unosa napitaka na koncentraciju mokraćne kiseline u plazmi Promjene u plazmatskim vrijednostima mokraćne kiseline nakon konzumacije testiranih napitaka i primjene kisika. Plazmatske vrijednosti mokraćne kiseline mjerene su prije i nakon 60, 90, 120, 150 i 240 minuta nakon konzumacije crnog vina (∆), etanola+glicerola (▼), fruktoze (◊) i vode (■).

42. Učinak unosa napitaka na vrijednosti ukupnog antioksidacijskog kapaciteta plazme Promjene antioksidacijskog kapaciteta plazme nakon konzumacije testiranih napitaka i primjene kisika. Vrijednosti antioksidacijskog kapaciteta plazme mjerene su prije i nakon 60, 90, 120, 150 i 240 minuta nakon konzumacije crnog vina (∆), etanola+glicerola (▼), fruktoze (◊) i vode (■).

43. Učinak unosa napitaka na vrijednost koncentracije etanola u krvi ispitanika Promjene u koncentraciji etanola u krvi (BEC) nakon konzumacije testiranih napitaka i primjene kisika. BEC vrijednosti mjerene su prije i nakon 60, 90, 120, 150 i 240 minuta nakon konzumacije crnog vina (∆), etanol+glicerol (▼), fruktoze (◊) i vode (■).

44. Učinak unosa napitaka na vrijednost srčane frekvencije ispitanika

45. Učinak unosa napitaka na vrijednost srednjeg arterijskog tlaka ispitanika

46. ZAKLJUČCI

47. Unos crnoga vina, kombinacije etanola i glicerola te fruktoze izazvao je akutni umjereni porast koncentracije mokraćne kiseline u plazmi od približno 15%

48. Akutni umjereni porast koncentracije mokraćne kiseline u plazmi izazvan unosom ispitivanih napitaka smanjio je oksidacijsko oštećenje nastalo kao posljedica prethodno inducirane hiperoksije

49. Akutni umjereni porast koncentracije mokraćne kiseline u plazmi, neovisno o vinskim polifenolima i etanolu, spriječio je hiperoksijom potaknuto sniženje elastičnosti arterijske stijenke

50. Akutni umjereni porast koncentracije mokraćne kiseline u plazmi, neovisno o vinskim polifenolima i etanolu, spriječio je hiperoksijom potaknuti porast koncentracije markera oksidacijskog oštećenja u plazmi