MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes pr é paratives et/ou s é paratives

1. MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALESméthodes préparatives et/ou séparatives DEPROTEINISATION But Elimination des protéines d’un milieu biologique complexe Intérêt Eviter l’interférence des protéines sur la méthode de dosage Trouble gênant la spectrométrie, la fluorimétrie Inhibition de réaction colorimétriques Précipiter d’autres substances interférentes non souhaitées Procédés Physique : dénaturation par chauffage , précipitation puis ultrafiltration, dialyse Immunologique : précipitation sélective de complexe Ag-Ac Chimique par déshydratation Alcools éthylique, méthylique, acétone Sels minéraux : sulfate d’ammonium, de sodium, méthode appelée relargage qui évite la destruction de la structure spaciale des protéines par formation de sels insolubles en milieu neutre sulfate de zinc, soude, baryte, mais absorption sur le précipité de substances non protéiques contenues dans le milieu en milieu acide acide trichloracétique, perchlorique, autres sels (picrates molybdates. ..)

2. MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALESméthodes préparatives et/ou séparatives CENTRIFUGATION - SEDIMENTATION Principe Séparation des particules contenues dans un solvant (cellules, organites subcellulaires, macromolécules) Sédimentation Résultante de l’effet de 2 forces : pesanteur, viscosité du milieu Modifications de la sédimentation ralentissement : augmentation de la viscosité (dextran, ficoll) accélération : augmentation de la force de pesanteur = création d’une force centrifuge

3. MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALESméthodes préparatives et/ou séparatives CENTRIFUGATION Centrifugation Augmentation de la sédimentation proportionnelle au carré de la vitesse et au rayon de l’axe de centrifugation Remarques Centrifugation horizontale ou oblique Vérifier la vitesse (surtout faible) Eviter la décélération brutale Récipients variables, volumes variables Possibilité  20000 g Réfrigération possible

4. MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALESméthodes préparatives et/ou séparatives ULTRACENTRIFUGATION Principe Accélération élevée (> 100000g), température réfrigérée Ultracentrifugation préparative  Différentielle : mélange homogène  2 fractions (culot et surnageant)  En gradients de densité Zonale : gradient de saccharose, séparation selon les coefficients de sédimentation Isopycnique : chlorure de césium, séparation selon la densité

5. MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALESméthodes préparatives et/ou séparatives ULTRACENTRIFUGATION Remarques :  la forme du gradient est importante Gradient linéaire macromolécules, Gradient concave lipoprotéines (flottation) Gradient discontinu ou par paliers cellules, organites subcellulaires, homogénats, purification de virus, Gradient à paliers multiples  la préparation est manuelle ou informatisée  le remplissage est variable selon la nature du gradient  la récolte des fractions se fait à la pipette ou par pompe  l’analyse des fractions est discontinue ou en continu Ultracentrifugation analytique Diffère de l’ultracentrifugation préparative par les résultats attendus Renseigne sur les caractéristiques physiques des molécules La migration est souvent suivie par stroboscopiecoût

8. MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALESméthodes préparatives et/ou séparatives DIALYSE Principe : séparation des substances selon leurs capacités à franchir une membrane de dialyse (porosité définie) Membranes Cylindres allongés fermés à leurs extrémités Contiennent les substances à étudier Collodion ou cellophane, porosité : 2,4nm Variation possible de la porosité par étirement ou traitement chimique Facteurs d’influencenotion de temps de demi-dialysance Température Surface comparée au volume à analyser PH Méthodes Préparation des membranes (conservation possible à 4°) Préparation des boudins de dialyse (fermeture, lestage) Changement du liquide de contre dialyse fréquent Adaptation des techniques au volume à analyser Applications Dessalage, Concentration, Elimination de substances diffusibles Modification d’un pH

9. La dialyse principe modalités

10. MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALESméthodes préparatives et/ou séparatives FILTRATION Principe : sélection de substances par passage sur un filtre Types de filtres En profondeur Nature : substances fibreuses (ammiante, cellulose,coton,verre) agglomérées (verre frité, sable, charbon) Capacité de filtration (épaisseur, pression) Forme : filtres papier plats ou plissés, filtres en fibre de verre, tubes filtrants, papier séparateur de phase, plaques fritées (filtration sous vide) Ecran Nature : nitrate de cellulose, chlorure de polyvinyle Marques : Millipore, Sartorius, Gellman Filtration par arrêt des particules à leur surface (préfiltration) Filtration stérilisante (rincer si application culture cellules, triton) Utilisation en cytologie (transparisation par huile d’immersion)

11. Principes du filtre en profondeur et du filtre écran Filtre en profondeur Filtre écran Filtres en profondeur

12. Principe de montage d’un filtre écran Exemples de filtres écran Unités Millex

13. MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALESméthodes préparatives et/ou séparatives ULTRAFILTRATION Principe : séparation des substances selon leur taille moléculaire Les membranes jouent le rôle de filtre écran au niveau moléculaire Méthodes Membranes (250 à 500 mm) utilisées dans des cellules d’ultrafiltration (les plus utilisées = Diaflo) Pression par azote ou centrifugation Applications : concentrations de molécules, élimination de substances de faible PM, étude de la liaison macro-micromolécules, isolement de virus, suivi dechromatographie sur colonne Filtres à membranes capillaires (25mm) 4 types : HFU, HFD, HFO, HFG Montages en macrotubes, bécher, microbécher, microtube en T Précautions d’utilisation : rinçage, préfiltration millipore, température, pH, pression, solvants organiques, rinçage avant recyclage Applications : dessalage, concentration de liquides biologiques (CaCl2, PEG)

14. Ultrafiltration sur filtres à membranes capillaires Types de montages Types de fibres capillaires HFU : hollow fiber filtration PM > 30000 HFD : hollow fiber dialyse PM > 5000 HFO : hollow fiber osmose PM > 200 HFG : hollow fiber pour gaz gaz Applications Dessalage, concentration de liquides biologiques

15. MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALESméthodes préparatives et/ou séparatives CHROMATOGRAPHIE Définition Difficile, ensemble de méthodes basées sur des principes physiques différents. Description Méthode de séparation de composés fondée sur l’entraînement de ces composés par une phase mobile, appelée éluant ou solvant ces composés étant séparés les uns des autres par des interactions plus ou moins fortes une phase fixe ou stationnaire Points communs : utilisation d’un support (poudre très fine en grains, ou solide percé de canalicules  surface importante la substance à analyser circule dissoute dans un solvant convenable entre les particules du support ou les microcanalicules il se crée des interactions physiques entre les particules du support et la substance à analyser (van der Waals, polaires). Les liaisons sont rapides et réversibles ; elles dépendent de la nature chimique des substances et donc permettent leur séparation. Classification Plusieurs types de classification sont possibles : selon la nature des phases, selon les mécanismes moléculaires mis en jeu ou selon les technologies pratiques mises en œuvre. La description d’un procédé fait appel à toutes ces classifications qui sont complémentaires

16. MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALESméthodes préparatives et/ou séparatives CHROMATOGRAPHIE Mécanismes moléculaires Ils sont au nombre de 5 selon la nature des forces Ils sont utilisés séparément ou en association Adsorption : liaisons hydrogènes ou de Van der Waals cas particulier des liaisons hydrophobes (phase greffée) Echange d’ ions : le support est composé de molécules chargées Si charges + échange d’anions Si charges -  échange de cations Filtration en gel : support = tamis moléculaire - mbilles ou msphères calibrées de matière poreuse Grosses molécules exclues du gel De partage : solvant au moins binaire : eau et toluène ou gaz et liquide Séparation selon coefficient de partage entre phase mobile et phase stationnaire D’affinité : support spécifique - utilise la liaison enzyme-substrat ou Ag-Ac

17. MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALESméthodes préparatives et/ou séparatives CHROMATOGRAPHIE Dispositifs Chromatographie sur colonne en phase liquide Support de chromatographie Solvant de dilution de la substance à analyser (stationnaire) Solvant d’élution (mobile) Pression variable (basse, moyenne = 10 bars, haute >30 bars) Analytique, préparative ou gaz-liquide Chromatographie papier Feuille de papier filtre placée verticalement en enceinte fermée imprégnée de vapeur d’eau Solvant organique ascendant ou descendant Séparation des substances entre eau et solvant Révélation des « taches » Chromatographie couche mince = variante (couche de support sur verre) Choix des méthodologies selon substances et but à atteindre

18. chromatographie

19. MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALESméthodes préparatives et/ou séparatives ELECTROPHORESE Principe : déplacement de molécules chargées dans un champ électrique continu Facteurs Temps de migration, Force ionique du tampon Température Courant électrique continu Forces de freinage PH du tampon (important si substances amphotères)

20. MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALESméthodes préparatives et/ou séparatives ELECTROPHORESE Méthodes sur papier basse tension : protéines, révélation par colorants généraux ou spécifiques haute tension : petites molécules en esters de cellulose matrice homogène, séparation rapide (voltage élevé 30v/cm)volume échantillon petits protéines en gel d’agarose grande porosité : molécules haut PM et complexe supramoléculaires (mmunoélectrophorèse, électrofocalisation) en gel d’amidon effet tamis marqué, séparation en fonction de taille et charge (20v/cm) : protéines (inconvénient quantité <.10mg) en gel de polyacrylamide séparation selon charge et poids, verticale ou horizontale réticulation modifiable (% acrylamide) analytique et préparative (isofocalisation ou isotachophorèse) + agents dénaturants (urée ou SDS, analyse de structure)

21. Électrophorèse principe méthodes

22. MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALESméthodes préparatives et/ou séparatives Electrofocalisation séparation des protéines en fonction de leurs points isoélectriques  utilise des gradients combinés densité-ph, mélange de produits par intervalles de pH , grand pouvoir de résolution utilisable en milieu liquide, en gel de polyacrylamide, en gel granité Electrophorèse en 2 dimensions Association de électrofocalisation et électrophorèse en SDS Méthode très résolutive, analyse qques milliers de protéines Lecture des résultats par analyse d’image Isotachophorèse Séparation des ions (différence de mobilité en milieu electrolytique discontinu. Méthode séparative si support en gel granulé Immunophorèse Combinaison des méthodes Electrophorèse en champ pulsé Appliquée à l’étude du génome (séparation de ADN haut PM)