Regulating the p53 pathway Franck Toledo and Geoffrey M. Wahl

1. Regulating the p53 pathwayFranck Toledo and Geoffrey M. Wahl Fator de transcrição, ativa genes: Bloqueio de ciclo celular Apoptose (tb via citoplasmática usando transcritos que ativa) Senescência Reparo de DNA Metabolismo Inibida por MDM2 e MDM4 (MDMX) Co-ativada por p300 (acetil-transferase) Mutação em TP53 = 50% cancers E em seus reguladores, em muito do restante MDM2 é amplificado em 7% dos cancers (wt p53)

2. Modelos in vitro N-term: Transcription Activation Domain (TAD)  P300 Proline Rich Domain (PRD) DNA Binding Bomain (DBD) NLS (L) Tetramerization domain (4D) with NES (E) Basic C-term Domain (CTD) Modificações pós-traducionais Fosforilação em serina/treonina Acetilação de lisina

3. Cinases de estresse fosforilam p53 em TAD (S15, T18 e S20) e em PRD (T81)  solta MDM2, se estabiliza, tetrameriza e se acumula no núcleo (bloqueio de NES) • P300 se liga a PRD e acetila CTD (o que dá especificidade a DBD) e histonas • P53 ativa mdm2 (feedback negativo) dentre outros (p21, PUMA, BAX) • No citosol, liga BCL2 anti-apoptótica e mitocondria fura membrana externa • ...e isso ainda não é nada!

4. Specific residues are modified as shown, with phosphorylation (P) in orange (23 sites, geralmente for a de DBD, de maneira redundante por diferentes cinases, ex. S15), acetylation (A) in green, ubiquitylation (Ub) in purple, neddylation (N) in pink, methylation (M) in blue and sumoylation (SU) in brown.

5. Mutações (substituição homóloga) em camundongo Residues that are subject to stress-induced modifications and that have been targeted at the mouse p53 locus are shown. Below the protein are shown other targeted mutations which provided valuable information on p53 function, but did not precisely target residues modified by stress. p53QS não liga MDM2 mas não ativa transcrição pq não recruta HATs, nem se auto-acetila no C terminal, todavia gruda em cromatina sim, embora não rpevisto pelos experimentos in vitro. S18A eS23A quase não dão fenótipo. Troca no CTD de 7 K por R (p537KR) tb furou. Mutações em PRD inibem degradação por MDM2 mas há ativação de transcrição. R172H and R270H (DBD)  metástase

7. Human p53 mutation database 21.587 mutações, 15.911 sem sentido: Só 6 em S/T do TAD Só 2 em T81 do PRD Só 5 em S/T/K do CTD DBD já é um alvo muito mutado! 2.213/15.911 R175H e R273H  metástase em camundongo R175 mutada em 1.030 tumores (941 casos de R175H) Todo mutante que consegue dar apoptose consegue ativar transcrição de gene apoptótico, indo contra o papel citosólico.

8. Ativação do promotor de p21 em levedura

9. MDM2 e MDM4 MDM4 liga em p53 mas não ubiquitinila não... Bloqueia ativação por p53 Seu promotor não é ativado por p53 Forma heterodímero com MDM2 MDM2 -/- morre de apoptose BAX -/- recupera! MDM4 -/- morre de parada de proliferação, mais tarde P21 -/- é que recupera! MDM2meia vida p53 – é um oncogene! (10,5%) Nutlin3a inibe ligação de MDM2 a p53 MDM4co-repressor de p53 – tb é oncogene! (9,9%)

12. MDM2 e MDM4 No estresse (b) MDM2 se degrada e a MDM4 e p53 aumenta atividade (c, estrelona), mas daí ela mesma para terminar a estorinha induz MDM2 que degrada totalmente MDM4 para que p53 seja muito ativa. Mas quando o estresse acaba, MDM2 volta a degradar p53 (d) Mechanism seems to involve a regulated deubiquitylation of p53, MDM2 and MDM4 by the ubiquitin-protease HAUSP83, and the regulation of HAUSP binding by the adaptor protein DAXX97.

14. p53, p63, p73 e suas truncadasem TAD = dominante negativas

15. Integração de funções