Yük. Lis . Öğr . ZEHRA SEZER Prof. Dr. A. ŞENOL ERTÜRKOĞLU

1. Yük. Lis. Öğr. ZEHRA SEZER • Prof. Dr. A. ŞENOL ERTÜRKOĞLU

2. GİRİŞ • ENDOMERİYUM • MENSTRUEL DÖNGÜ • DESİDUA • DESİDUALİZASYON • İMPLANTASYON • FOXO1

3. GİRİŞ • İnsan endometriyum ; • menstruel döngü • endometriyumundesidualizasyonu • embriyo gömülme • -yeniden yapılandırma • - hücre yenilenmesi • Ekstrasellülermatriksin (ECM) • yeniden modellenmesi • (Nakano M ve ark, 2001; Noguchi Y ve ark, 2003)

4. GİRİŞ Desidualizasyon endometrialstromanın morfolojik ve biyokimyasal dönüşümünün gerçekleşmesidir. • Stromalfibroblast hücreleri faklılaşır ve yuvarlak salgı hücrelerine dönüşür. • prolaktin (PRL) • insülin benzeri büyüme faktörü bağlayıcı protein • (IGFBP-1) (Gellersen B ve ark, 2003)

5. GİRİŞ • FOXO (forkheadbox O) proteini ; • transkripsiyon faktörlerinden ‘forkheadbox’ (FOX) ailesinin bir alt sınıfına aittir. (Accili D ve ark, 2004)

6. GİRİŞ

7. AMAÇ • II. Ayrıca bu çalışmada endometriyal • stromal hücrelerde (ESC) • hCG ( insan koryonikgonadotropin ), • progesteron ( P; 4-pregnene-3,20-dione ) • östrojen ( E; 17 beta-estradiol ), • cAMP ( siklik adenozinmonofosfat ) • etkenlerinin FOXO1 düzeyine etkileri incelenmiştir. • İnsan desidua ve endometriyumunda FOXO1 ifadesini araştırmaktır. • konuyla ilişkili çok az çalışma vardır. III. İn vitrodesidualizasyonda FOXO1 ifadesi araştırılmıştır.

8. MATERYAL &METOD 1. DOKU ÖRNEKLERİ : • 32-45 yaş arasındaki (ort. 36 yaşında) => 39 hasta • servikal intraepitelyal neoplazi (CIN) ve uterus miyoması için histerektomi geçiren • Noyes ve arkadaşlarının histolojik kriterlerine ( Noyes RW ve ark ,1950 ) ve en son menstruel periyoda göre sınıflandırılmıştır. • 4 gruba ayrılmıştır ; • Proliferasyon fazında 12 örnek • Erken - sekresyon fazında 7 örnek • Orta - sekresyon fazında 10 örnek • Geç - sekresyon fazında 10 örnek • Desidua; gebeliğin ilk trimester döneminin sonlarında bulunan hastalardan elde edildi.

9. MATERYAL &METOD • Doku örnekleri ; • İkisi => PCR ve Western blot analizi yapılmak üzere sıvı nitrojende hızlı bir şekilde donduruldu. • Birisi => histolojik teşhis ve IHC boyaması için rutin histolojik yöntemlerle takip edilip parafine gömüldü. 2. RNA İZOLASYONU VE RT-qPCR -> FOXO1 mRNA miktarı incelendi. 3. İMMUNOHİSTOKİMYA BOYAMASI - > FOXO1 için 1:50 seyreltide primer antikor kullanıldı. 4. PROTEİN İZOLASYONU ve WESTERN BLOT ANALİZİ • GAPDH, Western blotand RT-qPCR analizi için kontrol olarak seçildi. • GAPDH geni bir housekeeping gendir.

10. MATERYAL &METOD 5. İNSAN ENDOMETRİYAL STROMAL HÜCRELERİN PRİMER HÜCRE KÜLTÜRÜ • Desidua tepkimesinin düzenleyici mekanizmasını araştırmak için HES hücrelerin primer kültürü yapılmıştır. • Her bir biyopsiden alınan HESC kültürleri 6 gruba ayrıldı; • cAMP (8-Br-cAMP: 0.5 m M ) • P (P: 10 –6 M ) • hCG (hCG: 10 IU/ml) • cAMP + P (8-Br-cAMP: 0.5 m M , P:10 –6 M ) • E+P (E: 10 –8 M , P: 10 –6 M ) • Kontrol ( stromal hücreler - rutin mediumda 24 ve 48 saat )

11. MATERYAL &METOD 6. İN VİTRO DESİDUA TEPKİMESİ • HES hücrelerin in vitro desidua tepkimesini uyarmak için 8-Br-cAMP (0.5 m M ) kullanıldı. • Kültür ortamında desidua tepkimesi, farklılaşma işaretleyicisi olarak PRL ifadesi kullanılarak değerlendirildi . • PRL kemilüminesans tarafından ölçüldü. 7. İSTATİSTİKSEL ANALİZ YAPILDI • p < 0,05 => anlamlı olarak kabul edildi.

12. BULGULAR

13. İnsan Endometriyum veDesiduasındaFOXO1 İmmunolokalizasyonu a b c d e f a proliferasyon fazı epitel hücrelerin sitoplazmasında zayıf boyama b-c-d sekresyon fazı hücrelerin çekirdek ve sitoplazmasında kuvvetli boyama e-f ilk trimester stromal hücrelerin sitoplazması & epitel hücrelerin sitoplazma + çekirdeğinde kuvvetli FOXO1 boyama

14. İlk Trimester ve Menstruel Döngü Boyunca İnsan Endometriyumunda FOXO1 İmmunohistokimyasal Yoğunluk

15. Menstruel Döngünün Farklı Fazlarındaki İnsan Endometriyumunda ve İlk Trimesterdeki Desiduada FOXO1 mRNA İfadesi P<0.05 MS vs P & ES => anlamlı FT vs P-ES-MS-LS => anlamlı

16. Menstruel Döngünün Farklı Fazlarındaki İnsan Endometriyumundave İlk Trimesterdeki Desiduada FOXO1 Protein İfadesi P < 0.05 MS - LS vs P- ES => anlamlı FS vs P-ES-MS-LS => anlamlı

17. HESC’decAMP, P, P+E, cAMP+P ve hCG‘nin FOXO1 düzeyine etkileri

18. Hücre İçindeki FOXO1 Protein Yerleşiminin cAMP ve P Tarafından Düzenlenmesi

19. HESC’deDesidualizasyon Boyunca 8-Br-cAMP FOXO1 Protein İfadesini Düzenlemesi

20. TARTIŞMA ve SONUÇ • Bu çalışma, • menstrüel siklus boyunca endometriyum ve erken gebelik desiduasında FOXO1 mRNA – protein ifadesi ile FOXO1 hücresel yerleşiminin ilk detaylı araştırmasıdır. • HES hücrelerinin çekirdeğinde FOXO1 in vitro ifadesinin cAMP tarafından düzenlendiğini , • cAMP varlığında P’un HES hücrelerinin çekirdek ve sitoplazmasın- da FOXO1 ifadesini uyardığını, • cAMP uygulanan in vitro desidualizasyon boyunca FOXO1 ifade edildiğini göstermiştir.

21. TARTIŞMA ve SONUÇ • Sitoplazmik FOXO1 ifadesinin hücre çoğalması ile ilişkili olduğu daha önceki çalışmalarda gösterilmiştir. • Desidua hücre sitoplazmasında artan FOXO1 ifadesinin gözlenmesi, ilk trimester boyunca stromal hücre çoğalmasında FOXO1‘in potansiyel bir rolü olduğunu destekler.

22. TARTIŞMA ve SONUÇ • Tümör nekrozis ailesinden olan Fas-ligandpromoter FOXO1 bağlanma bölgesine sahiptir. • Çekirdekteki FOXO1 ifadesi apoptozis ile ilişkilidir. • Endometriyal hücre apoptozun gömülme ile ilişkili olduğu iyi bilinmektedir.

23. TARTIŞMA ve SONUÇ • Desidualizasyon ile ilgili genlerin çoğu geç-sekresyon fazında yüksek derecede ifade edilir. • Bu sorumlu genlerden bazıları: • urocortin(Torricelli M ve ark , 2007) • İnterleukin-15 (IL-15) (Okada S ve ark , 2000 ) • HOXA10 (homeobox A10) ( Vitiello D ve ark , 2008 ) • Lösemi inhibe edici faktör ( Kimber SJ ve ark , 2005) FOXO1, stromal hücre desidualizasyonun ilerlemesine katkıda bulunması için bu genler ile iş birliğinde olabilir.

24. TARTIŞMA ve SONUÇ • cAMP’nin çekirdekte FOXO1 mRNA ve protein ifadesini tetiklediği görülmüştür. • P, E ve hCG hormonlarının FOXO1 ifadesinde uyarıcı olmaması şaşırtıcıdır. • 8-Br-cAMP tarafından uyarılan FOXO1 ifadesi P uygulaması ile artmış ve FOXO1’in çekirdekten sitoplazmaya geçişi görülmüştür. • FOXO1’in en yüksek ifadesinin ilk trimesterdeki desidual hücre sitoplazmasında olması bu görüşü güçlendirmektedir.