PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE V BOTANICE 1) Princip metody Petr Koutecký, 201 2

1. PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE V BOTANICE 1) Princip metody Petr Koutecký, 2012 Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických oborů PřF JU

2. Turn on lasers, turn on flow, Turn on lasers, turn on flow. … When not at leisure, here’s what I treasure: It gives me plesure quickly to measure Cell as they go, cells as they go, … They scatter light, and absorb, and fluoresce; All this can be quantified with sucess. … (H. Shapiro, 2003,“Largo al FACStotum“)

3. Průtoková cytometrie • Metoda studující optické vlastnosti částic (cyto- = buňky) při ozáření určitým světlem • typicky laser (lasery) • měření rozptylu světla a intenzity fluorescence • Vzorky jsou ve formě suspenze, částice postupně protékají měřícím bodem • Metoda vznikla primárně pro analýzu krve v medicíně • dodnes nejčastější použití • nejvíce ovlivňuje směřování výzkumu a metodické inovace • … a taky komerčně dostupné aparatury

4. http://www.siumed.edu/~dking2/intro/bldcells.htm Historie • Mějme na paměti: historie FCM jekrvavá

5. Historie • První přístup - statické metody (scanning cytometry etc.) • Před: vizuální hodnocení preparátů pod mikroskopem • Automatizace procesu • měření nějaké optické vlastnosti v malé plošce preparátu • systematické posouvání („skenování“) preparátu • složení informace dohromady • 30. léta 20. stol. • T. Caspersson – microspectrophotometer • stanovení obsahu nukleových kyselin a případně proteinů měřením absorbance UV světla při 260, resp. 280 nm (primární motivace – odlišný obsah NK v normálních a abnormálních, tj. rakovinných buňkách)

6. Historie • 1950, Swift H.: The constancy of desoxyribose nucleic acid in plant nuclei, PNAS 36: 643–654 • analýza obsahu DNA v jádrech rostlin (Zea, Tradescantia) barvených Feulgenovou reakcí, měřena absorbance • důkaz konstantního množství DNA, násobky u různých typů buněk (gamety, somatické buňky), endopolyploidie [tento název ale později], označování 1C, 2C, 4C,… • porovnání obsahu DNA dvou druhů [poměr, ne abs. množsví] • 60. léta – první komerční přístroje (Zeiss), pokusy o auto-matickou klasifikaci krevních buněk a histologických preparátů (diagnóza rakoviny) • postupně různá řešení rastrování obrazu, nástup fluores-cenčních barviv, zavedení počítačů,…

7. Historie • pokud jde o stanovení velikosti genomu, vycházejí z tohoto přístupu 2 v současnosti používané metody: • Feulgen (micro)densitometry • preparát s jednou vrstvou buněk, barvení Feul-genovou reakcí (Feulgen & Rossenbeck 1924) • naštěpení DNA silnou kyselinou, na naštěpenou DNA se váže tzv. Schiffova báze (basic fuschsin), po navázání se mění z bezbarvé na růžovou • stechiometrický vztah (intenzita ~ obsah DNA) • měření absorbance (větš. λmax = 560 nm), v mnoha bodech • porovnání absorbance mimo jádra („blank“) a v jádře • součet absorbancí přes celé jádro, průměr přes celý preparát • porovnání se standardem o známém obsahu DNA jádra Allium cepa a Abies alba (Greilhuber 2008)

8. Historie • pokud jde o stanovení velikosti genomu, vycházejí z tohoto přístupu 2 v současnosti používané metody: • Image cytometry • podobná logika jako mikrodensitomerie, stejný chemický princip • místo měření jednotlivých bodů je CCD kamerou vyfocen obraz celého preparátu • výpočet založený na porovnání intenzity jednotlivých pixelů • mnohem rychlejší a asi i přesnější než tradiční mikro-densitometrie • Greilhuber 2008, Ann. Bot. 101: 791–804 [densitometrie] • Vilhar et al. 2001, Ann. Bot. 87: 719–728 [image cytom.]

9. Historie • Druhý přístup = měření částic v roztoku při průchodu měřícím bodem (flow cytometry, Coulter volume,…) • teoretický popis základního principu: A. Moldavan 1934 • první funkční přístoj ve 40 letech (Gucker et al. 1947) • počítal bakterie ve vzorku vzduchu, který byl unášen rychlejším proudem filtrovaného vzduchu, pomocí mikroskopie v temném poli měřen rozpyl světla [v dnešní terminologii SSC] • vývoj probíhal za 2. svět. války, sponzorován armádou USA • od přelomu 40. a 50. let podobné přístroje na počítání krvinek (bez odlišení jednotlivých typů) • ve 40. letech vyvinutí fluorescenčně značených protilátek,A. H. Coons (např.Coons et al. 1942, J. Immunol.45: 159–170) • hydrodynamic focusing: Crosland-Taylor 1953

10. Historie • 50. léta – W. Coulter, počítání krevních buněk metodou Coulter volume – měření elektrických, ne optických vlastností • suspenze buněk ve fyziologickém roztoku • roztok vodivý (ionty), vodivost buňky skoro nulová • suspenze protéká malým otvorem → zvýšení odporu ve chvíli, kdy je v něm buňka; závisí na objemu buňky • dodnes používáno v diagnostice (počítání krevních buněk) i výzkumu (>100 publ. na WOS za poslední 3 roky)

11. Historie • 1965 – Rapid Cell Spectrophotometer (RCS), L. Kamentsky, IBM • klasický mikroskop s UV lampou, buňky tekly do zorného pole kanálkem z boku (bez sheath fluid) • stanovoval obsah DNA měřením absorbance při 260 nm a později i fluorescenci na 1 nebo 2 vlnových délkách • z absorbance při 410 nm počítána analogie rozptylu světla [FSC v dnešní terminologii] • koncem 60. let přidána možnost třídit vybrané buňky (syringe pump sorter) • 1965 – popsán princip a sestrojen droplet sorter(M. J. Fulwyer)

12. Historie • 1969 – fluorimetrické měření obsahu DNA (tj. měření fluorescence) • modifikovaná Feulgenova reakce (Van Dilla et al. 1969) • ethidium bromid (Dittrich & Göhde 1969) – cytometr ICP (Impulscytophotometer), od roku 1970 komerčně prodávaný společností Phywe AG, Göttingen → dnes Partec • cca od 1970 – využití laserů jako zdrojů světla, nové fluorescenční látky,… (1973 – PI, 1977 – DAPI) • od 80. let zejména v medicíně zásadní zavedení fluorescenčně značených monoklonálních protilátek

13. Historie • další vývoj už „jenom“ vylepšování • motivace – důkladnější analýzy v medicíně (hl. imunologie, onkologie) • výkonnější elektronika, přesnější měření, vyšší rychlost,… • zavedení počítačů • nové fluorescenční látky – měření fluorescence několika vlnových délek naráz, excitovaných jedním zdrojem • zvýšení citlivosti – analýzy organel, virů, dokonce jednotlivých molekul,.. • měření dalších parametrů buněk (enzymová aktivita, pH, charakteristiky membrány, pronikání léčiv do buněk, exprese genů,…) • zmenšení na „bench-top“ rozměry, nižší cena

14. Historie – měření rostlin • první analýza genomu rostlin (densitometrie) Swift 1950 • první FCM analýza rostliných jader: Heller F. O. (1973): DNS-Bestimmung an Keimwurzeln von Vicia faba L. mit Hilfe der Impulscytophotometrie. – Ber. Deutsch. Bot. Ges. 86: 437–441 • protoplasty připravené enzymatickým odbouráním buněčných stěn • lýze protoplastů, barvení jader EtBr • měřeno na ICP od firmy Phywe (Partec) • popsání přípravy suspenze jader sekáním žiletkou:Galbraith et al. (1983): Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in intact plant tissues. – Science 220: 1049–1051 • masivní využití až od poloviny 90. let

15. Průtkový cytometr v kostce

16. Průtokový cytometr v kostce vzorek kyveta zdroj světla • laser • UV lampa / UV dioda optika + počítač fluidika • pumpa • sheath fluid odpad

17. Fluidika • sheath fluid = destilovaná voda (příp. s trochou detergentu a NaN3) • nebo fyziologický roztok • vzorek vytlačován tlakem vzduchu, vyšším než tlak sheath fluid) • alternativa – píst („injekce“) • v komůrce se vzorek dostávádo proudu sheath fluid http://flowbook.denovosoftware.com/

18. Shapiro 2003 pozn.: Partec má opačnou orientaci Fluidika Laminární proudění • citlivost na bubliny, nečistoty,… • rychlost hraniční vrstvy = 0, pak se zvyšuje úměrně (R - r)2 Hydrodynamic focusing • zvýšení rychlosti toku zúžovánímkyvety • velmi úzký (~μm) core stream, prostorová separace částic f = rychlost (např. ml/s) D = průměr kyvety • zvýšení fsamp vede k rozšíření core stream = menší přesnost

19. http://flowbook.denovosoftware.com/ http://flowbook.denovosoftware.com/ Fluidika Měřící bod (interrogation point) • v kapiláře kyvety (flow cell, flow chamber), obvykle syntetický amorfní křemen (quartz), obdélní-kový nebo čtvercový průřez, typicky 100-200 x 200-400 μm • stream-in-air – ve vzduchu pod otvorem komůrky, šířka ~50-100 μm • microscope based“ uspořádání – vzorek prochází pod objekti-vem mikroskopu kolmo na jeho osu

20. Zdroje světla Laser (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation) • různé typy, podle požadované vlnové délky • nejčastěji 488 nm (modrý) argon ion laser, případně doplněný o 635 nm (červený) dioidový laser • toto uspořádání je dáno použitými fluorescenčními barvami – většina je vyvíjena tak, aby byly excitovány právě těmito vlnovými délkami • cytometr Partec CyFlow v naší laboratořimá 532 nm (zelený) frequncy-doubled diode-pumped YAG solid state laser • optimální excitace propidium iodidu, maximum 536 nm (+ UV oblast) http://www.mcb.arizona.edu/ipc/spectra_page.htm

21. Zdroje světla Laser • monochromatické polarizované světlo • výchozí šířka paprsku ~1 mm • zaostřováno do eliptické oblasti cca 100 × 5-20 μm (delší rozměr kolmý na směr proudění částic) • důvod: intenzita světla v paprsku laseru je nestejná, zhruba Gaussova křivka (transverse emission mode:TEM00) • pro osvětlení core stream je třeba využít jen střed, kde je intenzita ± stejná, aby všechny částice dostaly stejné osvětlení • jde hlavně o rozměr kolmo na tok částic, aby částice v různě daleko od středu core stream byly osvětleny stejně • v podélném směru méně důležité, všechny částice jdou stejně

22. http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/lightsources/mercuryarc.htmlhttp://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/lightsources/mercuryarc.html Zdroje světla Rtuťová výbojka • Mercury arc lamp, používáme typ HBO 100 [výkon 100 W] • Emisní spektrum zahrnuje několik výrazných čar, hlavně v UV oblasti • Pro použití v cytometrii amikroskopii vybíráme jednuvlnovou délku pomocí optických filtrů • náš cytometr Partec PA II vy- užívá barvivo DAPI, max. excitace při λ = 358 nm http://www.mcb.arizona.edu/ipc/spectra_page.htm

23. Měřené parametry • Forward scatter (FSC) – rozptyl světla pod malými úhly • původní vlnová délka • interakce fotonu a elektronu → předání energie elektronu a zánik původního fotonu → okamžité předání (téměř) celé energie novému fotonu → (téměř) stejná vlnová délka, ale „libovolný“ směr a fáze • rozptyl je obecně do všech směrů, zaznamenáváme vždy jen část prostoru • obecně platí, že rozptyl je nejsilnější ve vlnových délkách, kde nedochází k absorbci fotonů – a naopak

24. Měřené parametry • Forward scatter (FSC) – rozptyl světla pod malými úhly • původní vlnová délka • malé úhly, cca < 10° od směru původního paprsku • z praktických důvodů se neměří blíž na cca 2°, původní (skoro) nerozptýlené záření blokováno stínítkem • informace o velikosti částice • vztah ale není lineární a asi ani monotónní (kromě objemu závisí i na mnoha dalších vlastnostech částic – indexu lomu, absorbci,…) • Side scatter (SSC) – rozptyl světla pod velkými úhly • větší úhly než FSC, obecně > cca 20°, typicky kolmo na původní paprsek (90°) • souvisí s velikostí částic a jejich vnitřní (např. granularita) a povrchovou strukturou

25. Měřené parametry • Absorbance • zeslabení intenzity záření původní vlnové délky • obvykle počítáno z opaku, tj. transmitance (podíl prošlého záření oproti původnímu) • dnes v průtokové cytometrii používáno málo, spíš v minulosti (např. měření obsahu DNA pomocí absorbance při λ = 260 nm, měření hemoglobinu při λ = 420 nm) • Fluorescence • nejdůležitější a nejčastěji používaný parametr

26. Měřené parametry • Fluorescence • absorbce fotonu vhodné vlnové délky,excitace elektronu do vyšší energe-tické hladiny • ztráta části energie bez vyzářenífotonu (vibrační stavy apod.) – řádověběhem pikosekund (10-12 s) • vyzáření fotonu, obvykle menší energie, tedy větší vlnové délky, než měl excitující foton – řádově během nanosekund (10-9 s) • průchod částice světelným paprskemv cytometru řádově delší (mikrosekundy, 10-6 s) http://en.wikipedia.org/

27. fluorescein http://www.invitrogen.com/ Měřené parametry • Fluorescence • rozdíl mezi excitačním a emisním maximem = Stokes shift • emisní a excitační spektrum často zrcadlového tvaru • potřebujeme, aby emisní spektrum (skoro) nezahrnovalo excitační vlnovou délku (kvůli měření rozptylu) 488 nm laser Stokes shift

28. Detekce světla • Ortogonální uspořádání • prakticky všechny cytometryvyužívající lasery • Uspořádání jako fluorescenčnímikroskop • u nás cytometr Partec PA II • epi-illumination • světla od zdroje (HBO lampa)prochází stejnou čočkou, kterásbírá signál (objektiv mikroskopu),osvětlení podle Köhlerova principu http://en.wikipedia.org/

29. Detekce světla • objektiv s velkou numerickouaperturou (světelností) • snaha posbírat co nejvíce světla • většinou „high-dry“ objektivy, schopné posbírat světlo z kuželeo vrcholovém úhlu max. 78°, tj. asi 11% světla vyzářeného doprostoru • některé cytometry mají kyvetu a objektiv pevně spojený optickým gelem → analogie imerzníhoobjektivu (max. vrcholový úhelcca 134°, tj. cca 30% světla) Shapiro 2003

30. Detekce světla Optické filtry • absorbční • barevné sklo nebo plast, absorbuje určité vlnové délky • levnější, účinnější, ale nevýhodou je vlastní fluorescence filtru • interferenční • sklo s tenkými vrstvou (vrstvami) dielektrického materiálu • v závislosti na tloušťce a počtu vrstev a vstupním úhlu světla dochází k interferenci – některé vlnové délky projdou, některé se odrážejí (resp. v přímém směru se vyruší interferencí) • často v podobě zrcadla (dichroic mirror) pod úhlem 45° (část záření prochází, část se láme o 90°) • obvykle menší transmitance a větší propustnost pro filtrované vlnové délky než absorbční filtry, ale bez vlastní fluorescence, přesnější selekce vlnových délek → v praxi někdy doplňována i tenká absorbční vrstva za vlastním filtrem

31. Detekce světla Optické filtry • dělení podle propouštěných vlnovýchdélek • short pass • long pass • band pass • neutral density filter • nemění vlnové délky, pouze celkovězeslabuje intenzitu • beam splitters • odráží malou část záření, bez selekcevlnových délek (v podstatě není filtr;běžná součást cytometrů) Shapiro 2003

32. Fluorescenční barviva (odbočka) Fluorescenční barviva pro stanovení DNA • Propidium jodid • interkalační barvivo (nespecifické vůči jednotlivím bázím), váže se i k RNA • v komplexu s dsDNA asi 30× vyššífluorescence než volná látka • max. excitace v komplexu s DNAλ = 536 nm (zelená), emisní maximum λ = 617 nm (oranžová) • další DNA barviva bez specifity k jednotlivým bázím • ethidium bromid • acridine orange (jiná fluorescences dsDNA a ssDNA a RNA!) http://www.sigmaaldrich.com http://probes.invitrogen.com/

33. Fluorescenční barviva Fluorescenční barviva pro stanovení DNA • DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) • váže se na skupiny AT párů (nejméně3 nebo 4 za sebou [odhady se různí])v malém žlábku dsDNA • v komplexu s DNA cca 20× vyššífluorescence než volná látka • max. excitace (v komplexu s DNA)λ = 358 nm (UV), emisní maximumλ = 461 nm (modrá) • váže se i s RNA, ale slabší fluores-cence (cca 20%) a λmax ~ 500 nm • vazba málo ovlivněna strukturouchromatinu – nízká cv http://www.sigmaaldrich.com http://probes.invitrogen.com/

34. Fluorescenční barviva • další barviva se specifitou k bazím • AT-selektivní: Hoechst dyes (Hoehst 33258, 33342, …) DIPI • GC-selektivní: mithramycin A chromomycin A3 (= CMA) olivomycin

35. Detekce světla Příklady uspořádání filtrů • Partec PA II (HBO 100 lampa, detekce fluorescence DAPI) • podle webu FCM labora-toře BÚ v Průhonicích • náš konkrétnípřístroj to mátrochu jinak 435 nm LP clona heat protection 700 nm SP dichroic mirror, LP 400 nm SP

36. Detekce světla Příklady uspořádání filtrů • Partec CyFlow SL (532 nm laser, detekce fluorescence PI + SSC a FCS + max. 2 další fluorescenční kanály) • podle manuálufirmy Partec • náš konkrétnípřístroj to mátrochu jinak

37. Detekce světla Fotoelektrický jev • působením světla (fotonů) o dostatečné energii dochází k uvolňování elektronů do vnějšího prostředí (u vodičů – vnější fotoel. jev) nebo z valenčního do vodivostního pásu (u polovodičů – vnitřní fotoel. jev) • energie fotonů musí být vyšší než prahová hodnota (energie nutná pro uvolnění elektronů z vazby) • při zapojení do elektrického obvodu vzniká el. proud, jeho intenzita závisí na intenzitě záření • právě tohoto jevu se využívá při detekci světla v cytometrii

38. Detekce světla Fotonásobiče (photomultiplier tube, PMT) • fotokatoda • série elektrod (dynody) o vzrůstajícím napětí • anoda • mnohonásobné zesílení proudu(počet elektronů) • v praxi v FCM až 106× • závisí na rozdílu napětí – ovlivňujeme parametrem gain • kvantový výtěžek (počet elektronů / počet fotonů) do 30% (pro krátké vlnové délky, pak klesá) • konverze proudu na napětí → měření → zpracování signálu Fotodiody – plovodičové, alternativa PMT – vyšší kvantový výtěžek, ale nemají gain → malé výstupní proudy Shapiro 2003

39. width voltage height threshold time Detekce světla Měřené charakteristiky • pulse heigth • intenzita • pulse area • pulse width • obě popisují průběh v čase • lze použít pro oddělení „slepených“ částic (stejná intenzita, jiný časový průběh)

40. Zobrazení výsledků • histogram • pro jeden parametr • osa X = parametr(např. fluorescence) • osa Y = počet částic • lineární × logaritmická škála • vzdálenosti píků • CV (na log škále teoreticky stejné u všech píků) • počty částic (lineární – peakarea; log – peak height)

41. Zobrazení výsledků • 2D diagramy • dotplot • pseudocolour plot • contour plot • density plot • … • 3D diagramy • uložení do počítače • .fcs(FlowCytometryStandard) • verze 2.0 × 3.0

42. Trigerring • vyhodnocuje se jen signál surčitou intenzitou • vyšší než určitá úroveň (threshold) • odfiltrování šumu • obvykle jeden z měřených parametrů • označován leading trigger nebo discriminator • částice s nižší intenzitou se nezaznamenávají • v našich aplikacích fluorescence • v imunologii často FSC / SSC • při detekci imunofluorescence jsou zajímavé i negativní buňky

43. Citlivost přístroje • různé zdroje šumu • fluktuace ve zdroji světla • fluidika • autofluorescence • elektronika • … • jednotky MESF • molecules of equivalent soluble fluorochrome • kalibrační částice se známým počtem molekul → kalibrační přímka → detekce stejných částic bez barviva (např. FSC) → výpočet odpovídající intenzity fluorescence • možná absolutní jednotka v histogramech (osa X) ? Shapiro 2003

44. Přesnost měření • koeficient variance (CV) • vyjadřuje variabilitu v hodnotách daného parametru • směrodatná odchylka / průměr • pro stejné částice teoreticky 0 (žádná variabilita), v praxi >0%; pro měření DNA pokud možno pod 3% • FWHM (full width at half maximum heigth) • odhad s.d., vychází z tvaru Gaussovy křivky,s.d. ~ FWHM / 2.36 • linearita • do jaké míry odpovídají naměřené intenzityskutečným násobkům (např. G1 vs. G2 fáze;„slepená“ jádra či kalibrační částice) • u našich přístojů do cca ± trojnásobku

45. Gating • výběr jen části pozorování podle určitého kriteria • automaticky × ručně • kombinace různých parametrů • lze v několika stupních • data → výběr (např. FSC × SSC) →výběr z výběru (např. fluorescence) → výpočet • např. výběr určité buněčné populace pro další analýzu

46. (Spektrální) Kompenzace • měříme více parametrůnajednou • např. fluorescence různých látek, překryvspekter, viz příklad: FITC (fluoresceinisothiocyanate) + R-phycoerythrin • ve žluté oblasti (PE)má určitou fluorescenci i FITC → signál i v nepřítomnosti PE • a symetricky naopak • fluorescenci „nechtěné“ barvy je třeba „odečíst“ • z tvaru křivky lze spočítat, kolik světla (% maxima) je na dané vlnové délce → suma přes rozsah vln. délek → toto se odčítá • vzájemně pro každou barvu – sada n rovnic o n neznámých… http://www.invitrogen.com/

47. Třídění (sorting) • možnost vybrat ze suspenze částice určitých vlasností • na základě rozptylu, fluorescence,… • definujeme určitý rozsah parametrů (gate) pro vybírané částice • obecně tři kroky • měření • rozhodnutí, zda nás daná částice zajímá - sorting decision(na základě daných parametrů) • vlastní třídění • třídit lze skoro cokoliv • buňky • organely • chromosomy • …

48. Třídění (sorting) Droplet sorting • stream-in-air uspořádání • proud kapaliny ve vzduchu nestabilní → rozpad na řadu kapek, ± chaoticky • při aplikaci vibrací určité frekvence vznikají kapky pravidelně • piezoelektrický jev – mechanická deformace krystalu (určité typybez centra symetrie) → vznikelektrického náboje na plocháchkrystalu → při návratu zpět vznikelektrického proudu • funguje i opačně – aplikace stří-davého proudu → vibrace o stejné frekvenci

49. http://www.gene-quantification.de/single-cell-handling.html Třídění (sorting) Droplet sorting • rozpad proudu na kapky v konstantnívzdálenosti (~ mm) • konstantní rychlost (~ 10 m / s) • konstantní vzdálenost mezi kapkami (řádově stovky μm) • přesná synchronizace • čas od průchodu měřícím bodempo oddělení kapky • čas mezi oddělením kapek

50. http://www.gene-quantification.de/single-cell-handling.html Třídění (sorting) Droplet sorting • nabití proudu těsně před oddělením kapky se zájmovou částicí • po oddělení nese kapka určitý náboj • rozdělení kapek podle náboje mezidvěma opačně nabitými destičkami(deflection plates) • současné přístroje řádově 10 000 částic / s (teor. do 100 000 / s) • limit daný rychlostí elektroniky + vynechání částic (i chtěných) jdoucích těsně za sebou • fyzikální limit pro tvorbu kapek cca 250 000 / s